[发明专利]一种总胆碱的测定方法

权利要求书

1.一种总胆碱的测定方法，包括以下步骤：

（1）配制试验用缓冲溶液：配制弱酸性缓冲液，弱碱性缓冲液和酶反应液；

所述弱酸性缓冲液是pH=4-7的乙酸钠缓冲液，

所述弱碱性缓冲液是pH=7-8的缓冲液，

所述酶反应液是混合酶反应液，混合酶反应液至少包含有胆碱氧化酶和磷脂酶D，用上述弱碱性缓冲溶液配制；磷脂酶D的浓度至少为0.7U/mL，胆碱氧化酶至少为0.8U/mL,；

（2）配制标准溶液：配制氯化胆碱标准溶液；

（3）用分光光度计测定氯化胆碱标准溶液的吸光系数；

（4）将样品预处理，然后用分光光度计测定经过预处理的样品的吸光值，并计算出样品中胆碱的含量；可见光分光光度计在400-450nm波长测试样品的吸光系数；

其特征在于：

步骤（4）中样品的预处理及测定，包括以下步骤：

（4a）取含有胆碱的饲料样品，粉碎至粒度小于0.45mm，加入无水乙醇，溶解分散均匀，样品混合均匀后进行酸碱水解处理样品，搅拌使样品分散均匀，水浴加热至50-80℃，加热时长170-240分钟；而后振荡均匀，调节pH至弱酸性，并用步骤（1）中配制的弱酸性缓冲液定容；

酸碱水解处理样品时：如果样品为植物性原料则加入酸液，如果样品为动物性原料则加入碱液；

所述酸液是有机酸溶液或无机酸溶液；

所述碱液是有机碱溶液或无机碱溶液；

（4b）加入活性炭吸附脱色，涡旋振荡，离心，取上清液过滤，收集滤液用于测定；

（4c）用于测定的滤液，加入10-20倍体积的酶反应液，保证用于测试的滤液呈弱碱性；

在37℃左右保温反应10-60分钟；

以样品空白为参比，在步骤（3）中相同的测试波长下，测试样品溶液的吸光值，并计算胆碱的含量。

2.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，混合酶反应液含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D。

3.根据权利要求2所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，混合酶的浓度分别为胆碱氧化酶1.0-1.2U/mL、过氧化物酶2.5-2.8U/mL、邻联茴香胺1mmol/L、曲拉通浓度为1%和磷脂酶D 0.75-1.0U/mL。

4.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，所述弱碱性缓冲液是Tris-盐酸缓冲液。

5.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，在420nm测定吸光系数。