[发明专利]一种总胆碱的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种总胆碱的测定方法，属于化学成分分析技术领域，特别适用饲料成分分析应用。

背景技术

胆碱(choline)，分子式为C₅H₁₄NO⁺X^-，胆碱是机体内许多生理功能所必需的营养物质，在构成细胞结构、维持脂质代谢、保证神经系统的正常功能方面发挥重要作用，是动物饲料中需要添加的重要营养物质。胆碱在动植物界广泛存在，尤其是谷物、豆科类及菜粕类副产品，此外，鱼粉和肉骨粉也都是胆碱的丰富来源。饲料生产中要求客观、准确地评定胆碱含量，合理科学地制定饲料配方。

已报道的饲料中总胆碱的测定方法有以下几种：①基于雷氏盐和四苯硼钠络合反应的分光光度计法，该方法测定误差较大是因为四苯硼钠测定胆碱会受到钾、钠、胺离子干扰，雷氏盐会受到三甲胺等季胺盐的干扰；②气相色谱法，该方法需要将季胺胆碱降解成叔胺，添加内标，然后衍生测定，操作繁琐且重重复性差；③液相色谱法，样品中的胆碱利用示差折光检测器进行测定，该方法虽然灵敏，但对仪器和操作人员要求高、且费用高、难以普及；④离子色谱法，NY/T 1819-2009《饲料中胆碱的测定离子色谱法》，该方法未建立原料水解步骤，检测出原料胆碱含量测定结果非常低，通常低于200mg/kg，而这些与实际情况(即一般原料胆碱含量应在1000mg/kg以上)是极不相符。导致该问题的原因是饲料中胆碱多以复合磷脂的形成存在，游离形式胆碱很少，需要经过彻底水解释放出胆碱部分，总胆碱才能被准确定量。因此，NY/T 1819-2009不适用于原料总胆碱测定，且原料采用强酸或强碱水解释放出游离态胆碱成为定量的首个关键步骤。

同时，GB/T 5413.20-2013《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》中，虽选用强酸水解，但未对原料水解液作净化处理，即存在以下问题：原料中富含核黄素等发色物质，原料经水解后颜色加深，造成原料背景值增高；且原料富含维生素C等还原性物质，会阻碍酶的氧化反应，造成胆碱测定值偏低。因此，原料水解液净化处理成为胆碱准确定量的第二个关键步骤。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术测试饲料中胆碱时，必须采用大型色谱设备，应用困难，且饲料中胆碱释放不完全，容易受到背景因素干扰，测试结果不准确的问题，提供一种检测饲料中总胆碱的方法。本发明的方法可以用于饲料原料、配合饲料、添加剂预混合饲料中总胆碱浓度的定量测定。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种总胆碱的测定方法，包括以下步骤：

(1)配制试验用缓冲溶液：配制弱酸性缓冲液，弱碱性缓冲液和酶反应液。所述弱酸性缓冲液是pH＝4-7的缓冲液，优选为pH＝4.0的缓冲液，特别是乙酸钠缓冲液。所述弱碱性缓冲液是pH＝7-8的缓冲液，优选为pH＝8.0的缓冲液，特别是Tris-盐酸缓冲液(也称Tris缓冲液)。所述酶反应液是混合酶反应液，混合酶反应液至少包含有胆碱氧化酶和磷脂酶D。优选的，磷脂酶D的浓度至少为0.7U/mL，优选为0.75-1.0U/mL。胆碱氧化酶至少为0.8U/mL，优选为1.0-1.2U/mL。胆碱氧化酶可以在弱酸至弱碱性的条件下发挥酶催化反应的作用，而磷脂酶D在弱碱性的条件下能够发挥出较好的活性，所以优选使用弱碱性的缓冲液配制酶反应液。

进一步，上述弱酸性缓冲液为乙酸钠缓冲液，pH＝4.0，摩尔浓度为0.2mol/L的。上述弱碱性缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为0.1mol/L，pH＝8.0。

进一步，所述混合酶反应液含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D。这些混合酶的浓度分别为胆碱氧化酶1.0-1.2U/mL、过氧化物酶2.5-2.8U/mL、邻联茴香胺1mmol/L、曲拉通1％和磷脂酶D 0.75-1.0U/mL。更优选的，所述混合酶反应液：用Tris-盐酸缓冲液配制含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D的混合酶反应液。磷脂酶D的反应活性是影响混合酶反应液的酶催化反应的关键步骤，优选保证其磷脂酶的活性，使用Tris-盐酸缓冲液配制的混合酶液整体活性最佳，使用效果最好。

(2)配制标准溶液：配制氯化胆碱标准溶液。

(3)用可见光分光光度计测定氯化胆碱标准溶液的吸光系数。