[发明专利]一种碳纳米管/纳米金复合膜电化学免疫传感器及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种电化学免疫分析的方法，确切说，涉及一种利用碳纳米管/纳米金复合材料建立电化学免疫传感器，应用于水体中微囊藻毒素检测的研究，属于电化学分析技术领域。

背景技术

微囊藻毒素是由淡水蓝绿藻产生的一类毒性强、急性危害大的环七肽缩氨酸肝毒素，对水生生物、饮用水安全和人类健康产生严重影响。其中微囊藻毒素-（亮氨酸-精氨酸）（MCLR）是最常见、急性毒性最大的微囊藻毒素之一。水体中微囊藻毒素的含量已被多个国家和组织作为衡量水质标准的一个重要指标。

目前，对水体中微囊藻毒素常用的检测方法主要包括主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术并取得一系列有价值的成果，但其仪器设备价值昂贵、操作繁琐且对操作人员技术要求较高；植物细胞的生物测试法和蛋白磷酸酶抑制法灵敏度相对较低；酶联免疫吸附法灵敏度较高，但其线性范围较窄。在传统检测方法得到广泛应用的同时，人们也不断将新技术引入到微囊藻毒素的测定中，以期待建立更快速、更灵敏的微囊藻毒素检测方法。

发明内容

本发明为了满足微囊藻毒素快速检测和饮用水质量安全的需求，提出利用碳纳米管/纳米金复合膜建立电化学免疫传感器，应用于水体中微囊藻毒素检测的研究。

为实现以上发明的目的，本发明采用下述技术方案：在玻碳电极表面修饰碳纳米管，并用多电位阶跃法在碳纳米管表面沉积纳米金制得碳纳米管/纳米金复合膜。通过纳米金和微囊藻毒素-（亮氨酸-精氨酸）抗体之间的吸附作用，将抗体固定于电极表面，以牛血清白蛋白封闭非特异性吸附位点。采用“三明治”免疫分析模式构建电化学免疫传感器，并将其应用于水体中微囊藻毒素的检测研究。

一种电化学免疫传感器的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）碳纳米管/纳米金复合膜的制备

玻碳电极（GCE，Φ=3 mm）用Al₂O₃抛光至镜面，依次用丙酮、硝酸溶液（1.0 mol/L）、氢氧化钠溶液（1.0 mol/L）及二次蒸馏水超声清洗5 min。将处理好的玻碳电极吹干后，滴涂10 μL 碳纳米管（CNTs）溶液并在红外灯下烘干。然后把制得的玻碳电极/碳纳米管（GCE/CNT）电极放入含有0.10 mmol/L 氯金酸的硫酸溶液（0.50 mol/L）中，用多电位阶跃的方法在电极表面沉积纳米金（AuNPs）（在1.055 ~ –0.045 V 的阶跃电位范围内扫描15 s）制备玻碳电极/碳纳米管/纳米金（GCE/CNT/AuNP）电极，待用；

（2）基于微囊藻毒素-（亮氨酸-精氨酸）抗体的电化学免疫传感器的制备

电极用二次蒸馏水清洗并吹干后，滴涂10 μL微囊藻毒素抗体并在37oC条件下孵育60 min，然后用磷酸缓冲溶液（PBS）清洗电极以除去未结合的抗体并晾干。在电极表面滴加10 μL 2%牛血清白蛋白溶液并培养30 min以封闭活性位点，构建电化学免疫传感器。

电化学免疫传感器检测微囊藻毒素的方法，按照下述步骤进行：

（1）“三明治”免疫分析模式的建立

免疫传感器清洗并吹干后，将其放入一定浓度的微囊藻毒素溶液中，在37 oC下培养60 min。用PBS清洗电极后，将10 μL辣根过氧化物标记微囊藻毒素抗体涂于电极表面并培养60 min构建“三明治”免疫分析模式。

（2）电化学检测：

用水清洗电极并将其放入5 mL含有0.80 mmol/L双氧水和0.50 mmol/L对苯二酚的PBS中，用微分脉冲伏安法进行定量检测，扫描范围为 0.40 ~ –0.6 V。以对苯二酚为电子媒介体，通过辣根过氧化物酶催化双氧水产生的响应电流实现了对微囊藻毒素的检测。所有测试均在室温下进行。

作为本发明的进一步改进，所述碳纳米管/纳米金复合膜在增大材料的比表面积、提高表面反应活性、改善催化反应的动力学条件等方面突破了单一组分材料性能的局限，表现出良好的生物亲和性、导电性、高催化活性等突出优点。

作为本发明的进一步改进，所述传感器采用辣根过氧化物酶标记抗体作为检测信标，能够放大电流信号从而提高微囊藻毒素检测的灵敏度。

作为本发明的进一步改进，所述电化学传感技术采用“三明治”免疫分析模式用于微囊藻毒素的检测具有良好的选择性，从而在很大程度上能够降低水体中其它蓝藻毒素（如节球藻毒素、鱼腥藻毒素-a和石房蛤毒素）干扰检测结果引起的假阳性误差。