[发明专利]一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种用权利要求1所述通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，其特征在于，包括：

(1)人冠状病毒检测通用引物设计

通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区设计了一对简并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于对人冠状病毒感染的初步确诊，引物对序列分别为上游引物hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为605bp；

(2)人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测验证

利用QIAamp Viral RNA Mini kit分别从四种人冠状病毒：HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-HKU1的阳性样本中提取病毒RNA，然后以hCoV-For和hCoV-Rev为引物对，通过One-step RT-PCR Quick Master Mix对四种人冠状病毒分别进行检测验证。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对四种人冠状病毒分别进行检测验证的反应体系为25μL：2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5μL，50mM Mn(OAC)21.25μL，10μM hCoV-For 和hCoV-Rev各1μL，病毒RNA 5μL，去离子水7.25μL；反应程序为：90℃30s，60℃30min，94℃，1min；94℃30s,56℃30s,72℃1min,35个循环；72℃7min；反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行One-step RT-PCR反应后都能扩增出大小600bp的单一目的条带，PCR产物经测序验证后序列正确且不存在交叉反应。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测验证包括人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测灵敏性验证和人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测特异性验证。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测灵敏性验证，利用QIAamp Viral RNAMini kit提取人冠状病毒RNA，并用分光光度计进行定量，并通过公式计算出每微升的拷贝数，将病毒RNA进行稀释，然后分别取各个稀释倍数的RNA为模板进行RT-PCR，结果表明，每反应病毒RNA拷贝数从1.6x109到1.6x103是均能扩增出目的条带，而每反应病毒RNA拷贝数从1.6x102到1.6x100均不能扩增出目的条带，上述结果表明，该人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR最低检测下限为1600拷贝/每反应，与常规单一冠状病毒检测所用RT-PCR及real-time RT-PCR灵敏性相当。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述人冠状病毒 通用引物One-step RT-PCR检测特异性验证，病毒RNA分别以HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1以及Influenza virusA、Influenza virus B、诺如病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、人鼻病毒为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为引物对进行PCR扩增，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行One-step RT-PCR反应后都能扩增出大小为600bp的单一目的条带，而加入其它病毒RNA模板均不能扩增出条带，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异性较好。