[发明专利]一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和病毒学领域，更具体涉及一种新的利用一对简并引物，通过One-step RT-PCR反应即可达到对人冠状病毒感染定性检测的目的。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢式病毒目(orderNidovirals)、冠状病毒科(family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员，基因组为单链、正链的RNA，全长在26～32kb之间，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类等都易感。近几年来，又从白鲸、骆驼，尤其是蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。冠状病毒依据核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会(ICTV，2012)在第九次报告中将冠状病毒属又分成了α、β、γ及δ共四个亚组。人及其他哺乳类冠状病毒主要位于α和β亚组，禽类及其它鸟类冠状病毒主要位于γ和δ亚组。冠状病毒感染后，能够侵害机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神经系统等多种器官，造成不同程度的病理性损，从而引起不同程度的病理性疾病，严重者甚至能造成死亡。

人冠状病毒目前已知共有六种，分别是二十世纪60年代最早发现的人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCoV-229E)和HCoV-OC43；2002～2003年在我国广东地区出现并迅速爆发的严重急性呼吸道综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)冠状病毒SARS-CoV；2004年在荷兰分离的新型人冠状病毒HCoV-NL63；2005年在香港鉴定的新型人冠状病毒HCoV-HKU1以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)冠状病毒MERS-CoV。其中，HCoV-229E和HCoV-NL63位于α亚组，HCoV-OC43和HCoV-HKU1位于β亚组中的2a亚组，SARS-CoV属于β亚组中的2b亚组，MERS-CoV属于β亚组中的2c亚组。分子流行病学研究表明，人冠状病毒主要感染婴幼儿及免疫功能低下或缺陷者，既能感染上呼吸道引起发热、咳嗽、喉炎等普通感冒症状，又能感染下呼吸道引起支气管炎、毛细支气管炎及肺炎等急性呼吸道症状。其中，SARS-CoV和MERS-CoV感染后能够引发呼吸系统和肾功能衰竭，严重者甚至造成死亡。除了SARS-CoV和MERS-CoV外，冠状病毒在常见人呼吸道病毒感染中的平均检出率为15％(Perlman S,et al.2009)。

冠状病毒基因组不连续的复制转录机制、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase,RdRp)复制的低忠实性、广泛的宿主嗜性使其在进化过程中极易发生碱基的插入、缺失以及基因重组或重配，在此过程中新型别或新的冠状病毒不断出现。因此，深入开展冠状病毒及新出现的冠状病毒的分子流行病学调查，及时研发新的快速、灵敏的分子检测技术对于阐释冠状病毒跨种属传播的分子机制以及满足快速诊断的要求等具有重要意义。目前，人冠状病毒分子检测方法主要有常规RT-PCR、real-time RT-PCR及血清学诊断法。这些方法通常利用特异性引物针及探针对某一特定种类的人冠状病毒进行单一检测，属于盲筛检测，不仅费时费力，而且检测试剂昂贵且容易造成污染。

发明内容

本发明的目的是以GenBank上登陆的目前已知的六种人冠状病毒全基因组序列为基础，通过对人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区设计了一对简并引物用于对人冠状病毒的通用定性检测。

本发明提供的技术方案是：

一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，即：hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即：hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG。

一种用所述通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，包括：

(1)人冠状病毒检测通用引物设计