[发明专利]一种血小板抗体检测的免疫纳米磁珠酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，特别是涉及一种血小板抗体检测的免疫纳米磁珠酶联免疫检测方法。

背景技术

血小板表面具有复杂的血型抗原，包括ABO抗原、HLA-I 抗原及HPA抗原（存在于血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，GPⅠa/Ⅱa，GPⅠb/Ⅸ上）。这些抗原均可以刺激机体产生抗血小板抗体，使血小板遭破坏，导致患者血小板减少而出现紫癜、出血甚至死亡，引发的临床相关疾病包括肿瘤、白血病、特发性血小板减少症、新生儿血小板减少症及血小板输注无效等。

血小板输血是目前治疗血小板减少症和上述多种疾病的最主要手段之一。大量研究结果表明，患者输注血小板前进行抗体检测和交叉配型以筛选相容性的血小板进行输注，输血有效率大于70％，而仅ABO血型相同的随机输注血小板有效率低于30％。这不仅仅浪费了宝贵的血液，而且不相容血小板使病人体内生成血小板抗体，导致免疫反应，造成输血无效，患者也几乎无例外地病情加重。

目前在英国、法国和美国等少数发达国家，临床一般应用昂贵的试验程序、繁杂的HLA和血小板基因分型技术对患者HLA-I基因和血小板血型即HPA基因全系列谱抗原基因定型，选择合适血型的献血员血小板，之后再对少数患者应用。

而在我国，至今没有建立血小板献血员库，临床很难开展血型基因型相容性血小板输血，只有少数临床机构采用血清学方法进行血小板抗体检测和交叉配型，但效果仍不理想。其主要原因在于现有检测方法仍存在诸多缺点和不足，如血小板抗体检测“金标准”方法-单克隆抗体固着血小板抗原分析技术（The monoclonal antibody immobilization of platelet antigen assay, MAIPA）需要将血小板裂解，易引起抗原结构破坏而出现抗体漏检，同时操作步骤繁琐，样本检测量受限。而常见的红细胞免疫吸附试验（solid-phase red cell adherence, SPRCA）对实验操作人员技术要求高，弱阳性结果有时难以判定，并且所采用的指示红细胞保存时间短，难以推广应用。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种血小板抗体检测的免疫纳米磁珠酶联免疫检测方法，该检测方法简便、高效，结果准确、可靠。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种血小板抗体检测的免疫纳米磁珠酶联免疫检测方法，包括步骤为：（1）将磁化血小板与待检样本混合反应；（2）用磁力分离步骤（1）中已反应的磁化血小板并洗涤；（3）加入酶标抗人二抗反应；（4）加入底物显色并终止反应，得到检测结果。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述磁化血小板是免疫纳米磁珠通过抗人血小板单克隆抗体与血小板结合得到的。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述免疫纳米磁珠的制备过程为：在Fe₃O₄纳米磁性颗粒表面包覆SiO₂层得到Fe₃O₄@SiO₂微球，通过硅烷化反应对Fe₃O₄@SiO₂微球的表面修饰氨丙基三甲氧基硅烷（NH₂-CH₂-CH₂-CH₂-Si(OCH₃)₃、APS）得到免疫纳米磁珠，所述Fe₃O₄纳米磁性颗粒是通过高温热解法合成的，所述Fe₃O₄纳米磁性颗粒的大小为50-200nm且是饱和磁化强度。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述磁化血小板的浓度为100~200×10⁹/L，加样体积为50~100μL。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述待检样本为患者的血清或血浆，加样体积为50~100μL。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述磁力为磁棒或磁粒板所具有的磁力，所述洗涤是用含体积分数为0.03~0.06% 的Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述酶标抗人二抗为羊抗人IgG、兔抗人IgG或鸡抗人IgG，所述酶标抗人二抗中采用的标记物为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。