[发明专利]一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体及其制备和应用

权利要求书

1. 一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体，其特征在于，其为兔抗ISKNV-23P8 多克隆抗体，是以含有序列号为SEQ ID NO：1的一段氨基酸残基为表位抗原，获得特异性识别ISKNV-23P8的多克隆抗体；所述多克隆抗体通过以下方法制备得到：

1）合成多肽：以序列为SEQ ID NO：1的多肽片段为模板，用生物学方法合成多肽，用HPLC对合成的多肽进行纯化，纯度在85%以上；

2）耦联：将上述步骤1）合成多肽耦联至钥孔血蓝蛋白中，获得23P8-KLH复合物；

3）乳化：用弗氏完全佐剂对上述步骤2）得到的23P8-KLH复合物进行乳化；

4）免疫：用上述步骤3）的乳剂免疫新西兰大白兔，背部皮下多点注射，首免后10-15天，用弗氏不完全佐剂乳化的23P8-KLH进行一次加强免疫；

5）血清抗体的检验与制备：加强免疫后7天，用Western-blotting检测兔血清中特异抗体的生成情况；

6）亲和层析：利用ISKNV-23P8耦联的琼脂糖凝胶对血清中特异抗体进行亲和层析，获得兔抗ISKNV-23P8 多克隆抗体。

2.一种根据权利要求1所述的检测传染性脾肾坏死病毒的抗体的制备方法，其特征在于，其具体步骤如下：

1）合成多肽：以序列为SEQ ID NO：1的多肽片段为模板，用生物学方法合成多肽，用HPLC对合成的多肽进行纯化，纯度在85%以上；

2）耦联：将上述步骤1）合成多肽耦联至钥孔血蓝蛋白中，获得23P8-KLH复合物；

3）乳化：用弗氏完全佐剂对上述步骤2）得到的23P8-KLH复合物进行乳化；

4）免疫：用上述步骤3）的乳剂免疫新西兰大白兔，背部皮下多点注射，首免后10-15天，用弗氏不完全佐剂乳化的23P8-KLH进行一次加强免疫；

5）血清抗体的检验与制备：加强免疫后7天，用Western-blotting检测兔血清中特异抗体的生成情况；

6）亲和层析：利用ISKNV-23P8耦联的琼脂糖凝胶对血清中特异抗体进行亲和层析，获得兔抗ISKNV-23P8 多克隆抗体。

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5）的具体方法为：以ISKNV感染48小时后的MFF-1细胞培养上清为样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜，用10%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜，37℃，1h；然后分别加入1:4000倍稀释的兔血清，4℃，过夜后，用TBST清洗3次硝酸纤维素膜；然后加入2000倍稀释的HRP-羊抗兔IgG二抗，37℃，1 h，用TBST清洗3次硝酸纤维素膜，用DAB 显色试剂进行显色；待分子量为200KDa的蛋白显色则判定为ISKNV-23P8血清抗体阳性；通过耳部静脉血管采集兔子血液，室温下放置1小时后，4℃，过夜，3000rpm离心5分钟，收集血清。

4.一种检测传染性脾肾坏死病毒的免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，其包含如权利要求1所述的检测传染性脾肾坏死病毒的抗体。