[发明专利]一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物免疫技术领域，具体涉及一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体及其制备和应用。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)是虹彩病毒科(Iridoviridae)肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)的代表种，是一类具有正二十面体的胞浆型大型双链DNA病毒，基因组由111，362个碱基组成，包括125个预测开放读码框ORF(open reading frames)。ISKNV可以感染近60种淡水和海水鱼，是鳜、加洲鲈和美国红鱼养殖业的巨大威胁，鳜鱼是其主要感染宿。

鳜(Siniperca chuatsi)是鲈形目真鲈科鳜属的鱼类，俗称鳜鱼、花鲫鱼、桂鱼、季花鱼等，是中国特产的一种食用淡水鱼，也是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一；由传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)引起的鳜鱼虹彩病毒病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致顿死亡率接近100％，成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。自1994年以来，ISKNV引起了广东省的鳜养殖重大经济损失，其传染力强，发病率高达30％，致死率高达90％以上，平均每年经济损失高达2亿元。对ISKNV的感染进行检测，是防止该病毒病暴发的必要手段。目前国内外针对该病毒的诊断方法局限于聚合酶链式反应(PCR)技术，尚未有其它诊断方法的报道，PCR检测法需要提纯病鱼组织DNA，且假阳性率较高，限制了该方法的推广和使用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测传染性脾肾坏死病毒抗体，以多肽为抗原获得特异性的传染性脾肾坏死病毒抗体，该多肽序列与虹彩病毒属其它种病毒的同源性较低，无连续5个以上氨基酸相一致，该抗体用于检测传染性脾肾坏死病毒，具有特异性。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体，其为兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体，是以含有序列号为SEQ ID NO：1的一段氨基酸残基为表位抗原，获得特异性识别ISKNV-23P8的多克隆抗体。

本发明还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体的制备方法，通过该方法获得一种特异性识别ISKNV的多克隆抗体，用于荧光免疫检测传染性脾肾坏死病毒。

为实现上述目的，本发明中所述的制备方法的具体方案如下。

一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体的制备方法，利用Antigenic和DNA star/protean抗原决定簇分析软件对传染性脾肾坏死病毒毒株编码的膜蛋白VP23R的氨基酸序列进行分析，筛选出一段14个氨基酸残基抗原表位的多肽片段，并以该多肽片段制备抗VP23R蛋白的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体；所述多肽片段的序列为SEQ ID NO：1。

具体地，所述的制备方法包括以下步骤：

1)合成多肽：以上述多肽片段为模板，用生物学方法合成多肽，用HPLC对合成的多肽进行纯化，纯度在85％以上；

2)耦联：将上述步骤1)合成多肽耦联至钥孔血蓝蛋白(KLH)中，获得23P8-KLH复合物；

3)乳化：用弗氏完全佐剂对上述步骤2)得到的23P8-KLH复合物进行乳化；

4)免疫：用上述步骤3)的乳剂免疫新西兰大白兔，背部皮下多点注射，首免后10-15天，用弗氏不完全佐剂乳化的23P8-KLH进行一次加强免疫；

5)血清抗体的检验与制备：加强免疫后7天，用Western-blotting检测兔血清中特异抗体的生成情况；

6)亲和层析：利用ISKNV-23P8耦联的琼脂糖凝胶对血清中特异抗体进行亲和层析，获得兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体。

进一步地，步骤5)的具体方法为：以ISKNV感染48小时后的MFF-1细胞培养上清为样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜，用10％脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜，37℃，1h；然后分别加入1:4000倍稀释的兔血清，4℃，过夜后，用TBST清洗3次硝酸纤维素膜；然后加入2000倍稀释的HRP-羊抗兔IgG二抗，37℃，1h，用TBST清洗3次硝酸纤维素膜，用DAB显色试剂进行显色；待分子量为200KDa的蛋白显色则判定为ISKNV-23P8血清抗体阳性；通过耳部静脉血管采集兔子血液，室温下放置1小时后，4℃，过夜，3000rpm离心5分钟，收集血清。