[发明专利]一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用

权利要求书

1.一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌的维生素B₁₂合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物好氧合成维生素B₁₂的途径；所述维生素B₁₂合成途径的基因包括cobA、cobI、cobG、cobJ、cobM、cobF、cobK、cobL、cobH、cobB、cobN、cobS、cobT、cobR、cobO、cobQ、cobC及cobD；所述cobA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cobI的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，cobG的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，cobJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，cobM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，cobF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，cobK的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，cobL的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，cobH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，cobB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，cobN的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，cobS的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，cobT的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，cobR的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，cobO的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，cobQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，cobC的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，cobD的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；以pACYCDuet-1表达cobA、cobI、cobG、cobJ和cobM，pCDFDuet-1表达cobF、cobK、cobL、cobH和cobB，pETDuet-1表达cobN、cobS和cobT，pRSFDuet-1表达cobR、cobO、cobQ、cobC和cobD。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括DH5α、JM109、W3110、BL21(DE3)、MG1655。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA，连接后再与质粒pACYCDuet-1连接；将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF，连接后再与pCDFDuet-1连接；将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST，连接后再与pETDuet-1连接，构建质粒pETDuet-1-PgapA-cobNST；将PgapA和cobD，cobC和cobQ，cobO和cobR通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobD，cobCQ，cobOR，连接再与pRSFDuet-1连接。