[发明专利]一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌及其构建与应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

维生素B₁₂(Vitamin B₁₂,VB₁₂)，又称为钴胺素，分子式为C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P，分子量是1355.38。它是一类含有钴的咕啉类化合物的总称，是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子，也是唯一含有金属离子的维生素；其结晶为红色，故又称红色维生素。

1956年，Hodgkin等通过X-射线法证明了其晶体结构，即中心咕啉环、中心环轴向Coβ配基部分及1个含有核苷酸环的Coα配基，结构十分复杂。维生素B₁₂作为一种重要的维生素，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。目前，已广泛应用于饲料、食品、医药卫生和化妆品等领域。

1972年，美国科学家Woodward,R.B.领导100多位合作者历时11年，共同完成了维生素B₁₂的全化学合成。但由于其化学合成步骤多，收率极低，因此化学合成十分昂贵。早期，人们从动物肝脏、肾脏等组织提取维生素B₁₂，但收率和效益也十分低下。后来，从链霉素发酵废液中提取，收率仍然很低。目前，工业生产中维生素B₁₂的生产主要采用微生物发酵法。

自然界中，维生素B₁₂从头合成途径分为两条途径，一条是厌氧合成途径，存在于费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichi)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等细菌中；另一条是好氧合成途径，主要存在于脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(好氧菌株)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(兼性好氧菌株)中。目前，用于工业维生素B₁₂发酵的菌株主要是P.shermanii和P.denitrificans。培养基以葡萄糖为主要碳源，玉米浆为主要氮源，补加钴离子及前体5,6-二甲基苯丙咪唑(DMBI)。近年来，由于好氧发酵菌株具有诸多优点，如生长快、培养条件较为简单以及发酵易控制等。好氧发酵工艺是目前工业化生产维生素B12的主要工艺，全球80％以上的产量来自该工艺，以P.denitrificans为生产菌株，培养基采用甜菜糖蜜或麦芽糖为主要碳源，玉米浆或酵母膏为氮源，补加无机盐、钴离子以及DMBI。目前，国内外相关学者将注意力放在通过优化P.denitrificans的发酵工艺，以期提高维生素B₁₂的产量。

本发明在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌维生素B₁₂合成途径的基因， 采用不同拷贝数的表达载体对基因进行模块化组装，构建维生素B₁₂的从头好氧合成途径大肠杆菌工程菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌工程菌株，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的维生素B₁₂合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物从头好氧合成维生素B₁₂的途径。

所述维生素B₁₂合成途径的基因包括cobA，cobI，cobG，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobR，cobO，cobQ，cobC及cobD。

在本发明的一种实施方式中，所述维生素B₁₂合成途径的基因cobA，cobI，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobO，cobQ，cobC和cobD来源于类球红细菌，cobG和cobR来源于恶臭假单胞菌。