[发明专利]采用Taqman探针法鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害检测技术，特别是一种采用Taqman探针法鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法。

背景技术

小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一(王圆，1997)。在其流行年份，小麦矮腥黑穗病引起的产量损失一般为20％～50％，严重时可达75％～90％，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌瘿中的冬孢子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个国家将其列为检疫对象。我国在20世纪60年代把此病害列为检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在形态学上极为相似，难于区别。

传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的意义。

1996年Ferreira等首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病的鉴定中来，他们选择了印腥线粒体DNA的一个2.3kb的EcoR1片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物TI1/TI4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等通过克隆印腥线粒体DNA的Dra1片段，进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Ti17/M1和Ti17/M2能分别从印腥中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。2000年Frederick根据线粒体的差异设计了5对针对印度腥黑穗病的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑穗病的特异性引物，分别能将印度腥黑穗病菌株和黑麦草腥黑穗病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2，能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2,可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，以便于提供更简单的鉴定方法。2004年高强利用RAPD技术找到了一条可以将小麦网腥黑穗病菌株和小麦矮腥黑穗病菌株区别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条带，没能将二者分开。梁宏等人依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑穗病菌株从其近缘属种中鉴别出来。

发明人前期研究中获得TCK差异片段661bp(Seq ID No.1)，并根据所得差异片段获得TCK Scar标记及引物，见专利号201110051404.X记载。该标记能用于常规PC鉴定TCK菌，能够特异性地将TCK从近似菌种中鉴定出来。但是发明人发现，该专利中的标记引物及PCR方法不能很好地应用于预警小麦矮腥黑穗病以及筛选抗TCK小麦品种方面，可能是因为感染TCK且未表现病征的病株中，提取DNA后，TCK的DNA所占比例太小，也就是浓度太低，而普通PCR的灵敏性不足于检测到如此低浓度的模板。众所周知，实时定量PCR在灵敏度方面显著优越于普通PCR，因此发明人尝试将该专利中的Scar标记引物用于实时定量PCR来扩增TCK样本,但是无论是在实时荧光定量方法中还是在TaqMan水解探针法定量PCR中，从不同梯度的扩增曲线和标准曲线及溶解曲线来看，引物的特异性不好，标准曲线的扩增效率远远超过正常的效率是90-110％，因此引物与模板扩增有问题。

为了能顺利利用实时定量PCR方法鉴定小麦矮星黑穗病，有必要通过设计筛选适合于实时定量PCR方法的特异性PCR引物，优化PCR反应体系得出一套灵敏性高、特异性好的实时定量检测方法。

发明内容

本发明根据上述领域的现状及需求，根据前期研究中筛选到的TCK差异基因片段Seq IDNo.1，设计出TCK特异性引物及探针，基于ABI7500荧光定量扩增仪,优化Real-Time PCR反应体系，成功地建立TaqMan水解探针法定量PCR检测体系检测TCK和人工接种体系下不同生长期小麦的感病情况检测。

本发明建立的实时定量Taqman探针法检测TCK的技术方案如下：

用于鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的Taqman探针法，包括如下步骤：