[发明专利]产生非节段负链RNA 病毒的细胞和方法

说明书

本申请是申请日为2007年12月21日的第200780047473.5号发明名称为“产生非节段负链RNA病毒的细胞和方法”的中国专利申请的分案申请。

本发明涉及从克隆的脱氧核糖核酸(cDNA)特别是从麻疹病毒，特别是从减毒株例如批准用于接种的减毒株，特别是从减毒的Schwarz麻疹病毒和各种基于重组Schwarz麻疹病毒且表达异源序列的病毒产生非节段单链负义RNA病毒(NNV或单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales))的重组细胞以及方法。这些拯救的病毒可在扩增后用作免疫麻疹和/或免疫表达的异源肽或蛋白质的疫苗。

减毒活RNA病毒可制备为高效疫苗。在这些疫苗当中，麻疹疫苗已应用于数亿儿童，并已证实是安全有效的。注射一到两次后，该疫苗可诱导终身免疫。它很容易在大多数国家以低成本大规模生产。这些优点使得麻疹病毒尤其是减毒疫苗株成为免疫儿童和(甚至在某些情况下)成人使其抵抗麻疹和/或其他感染性病原体尤其是病毒性病原体例如AIDS(反转录病毒)、黄病毒或冠状病毒(SARS)病的良好候选载体。

自20世纪60年代以来，减毒活麻疹病毒已被用作疫苗，是最有效和最安全的人疫苗之一。大规模接种疫苗在发达国家可有效地控制麻疹。但是，由于疫苗在发展中国家分布不足，仍有大约4500万人感染麻疹，每年导致700,000名儿童的死亡。因此WHO已加大其针对接下来10-20年的全球疫苗接种项目的投入力度(C.D.C.,2005)。利用WHO的活动，采用安全有效的新多价小儿疫苗特别是双价小儿疫苗，使用源自麻疹疫苗的疫苗载体可在世界上某些地区为儿童进行麻疹或其他传染性疾病的同时免疫。

麻疹病毒(MV)属于副粘病毒科麻疹病毒属。它是一种具有非节段负链RNA基因组(15,894bp)的包膜病毒。麻疹仅可感染一次，因为免疫系统启动了强特异应答，并建立了终身记忆，避免发生重新感染。这种保护基于抗体生成和记忆细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞(CTL)。病原株强烈破坏血细胞生成(Arnebom等人，1983；Kim等人，2002；Okada等人，2000)，从而形成短暂的免疫抑制，而后者是发展中国家因麻疹感染所引起的大多数死亡的原因。与原始毒株相比，减毒株不会诱导免疫抑制(Okada等人，2001)。

1954年通过人原代细胞培养分离得到麻疹病毒的Edmonston株(Enders等人，1954)。经改造用于鸡胚成纤维细胞后，通过随后在鸡胚成纤维细胞中传代，得到了毒性进一步减弱的疫苗毒种。具有相同核苷酸序列的Schwarz株和Moraten株组成了最常使用的麻疹疫苗(Parks等人，2001a；Parks等人，2001b)。经一到两次注射进行接种可诱导终身免疫(Griffin等人，2001；Hilleman等人，2002)。已证实CD8细胞和抗体可在接种后存在多达25年(Ovsyannikova等人，2003)。麻疹疫苗在大多数国家容易投入大规模生产，且可以低成本制备。病毒基因组的减毒源自多个突变的有利组合。因此，该疫苗非常稳定，至今从未观察到疫苗株的回复突变(Hilleman等人，2002)。此外，该病毒仅在细胞质内复制，避免了整合到宿主基因组染色体上的任何风险。这些特征使得减毒活的麻疹疫苗成为开发多价疫苗载体的出色候选物。出于该目的，已克隆出对应于Edmonston B MV株反基因组的感染性cDNA，并建立起可产生相应病毒的反求遗传学技术。

发明人之前使用世界上最常使用的麻疹疫苗Schwarz MV已开发出一种载体(Combredet等人，2003)。该载体可在12次以上的传代过程中稳定表达许多基因或大基因的组合。产生含4,000-5,000个附加核苷酸的重组MV载体，表示附加的30％基因组。通过细胞培养产生滴度堪比标准MV的这些病毒。传代12次和10²⁰的扩增系数后，96％以上的感染细胞继续表达附加基因。同样在单分子负链RNA病毒目的其他成员中观察到的这种极为稳定的表达，很可能是因为没有这些螺旋核衣壳病毒对基因组大小的几何限制，这点不同于具有二十面体衣壳的病毒。而且，MC感染免疫系统的细胞(巨噬细胞和树突细胞)，从而将货物抗原直接传递给最有效的抗原呈递细胞，而这是疫苗载体的主要优点。最后，MV基因组很小，因此避免对该载体的应答超过对转基因的应答。