[发明专利]用于转染原生质体的改进技术

权利要求书

1.一种用于向植物细胞原生质体中引入一种或多种感兴趣的分子的方法，其包含如下步骤

-通过酶降解和/或从植物细胞中移除细胞壁来提供植物细胞原生质体；

-用能够诱导DNA双链断裂的组合物进行植物细胞原生质体的第一转染；

-采用一种或多种感兴趣的分子进行植物细胞原生质体的第二转染，所述分子选自化学品、DNA、RNA、dsRNA、蛋白质、寡核苷酸、mRNA、siRNA、miRNA、肽、质粒、脂质体以及致突变的寡核苷酸；

-允许细胞壁形成；

其中第二转染在第一转染之后进行，以及其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是至少1、2、4、6、8、10、12、16或24小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其中能够诱导DNA双链断裂的组合物选自锌指核酸酶、大范围核酸酶或TAL效应子核酸酶、编码锌指核酸酶的DNA构建体、编码大范围核酸酶的DNA构建体、编码TAL效应子核酸酶的DNA构建体。

3.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是96小时以下。

4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是从1小时至72小时。

5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是从2至48小时。

6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是从4至42小时。

7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是介于12和36小时之间。

8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种感兴趣的分子选自DNA、寡核苷酸、质粒以及致突变的寡核苷酸。

9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是基因靶向和/或靶向诱变。

10.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中第一转染和/或第二转染是PEG介导的转染。

11.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体

-在第一转染之前或与其同时；或

-介于第一和第二转染之间，或

-在第二转染之前或与其同时，或

-在第二转染之后。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法进一步包含移除抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物的步骤：

-在第一转染之前或与其同时；或

-介于第一和第二转染之间；或

-在第二转染之前或与其同时；或

-在第二转染之后，

以及在允许细胞壁形成之前。

13.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含同步植物细胞或植物细胞原生质体的细胞周期时相的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中同步通过采用同步化剂接触植物细胞或植物细胞原生质体来完成，优选

-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前、或与其同时；或

-在第一转染之前、或与其同时；或

-在第二转染之前、或与其同时；或

-介于第一和第二转染之间。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包含移除同步化剂的步骤：

-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前；或

-在第一转染之前、或与其同时；或

-在第二转染之前、或与其同时；或

-介于第一和第二转染之间；或

-在第二转染之后、或与其同时。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中同步步骤与采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体的步骤独立地，如在其之前、在其之后或与其同时进行。