[发明专利]用于转染原生质体的改进技术

说明书

本发明是申请号为201080057861.3，申请日为2010年12月20日，发明名称为“用于转染原生质体的改进技术”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于向植物细胞原生质体中引入感兴趣的外来分子的方法。发明还涉及转染的植物细胞原生质体和用于实施所述方法的试剂盒。

背景技术

遗传改造是刻意创造活细胞遗传物质变化的方法，所述方法目的在于改造那种细胞或者由细胞构成其一部分的器官或由细胞再生的器官的一种或多种遗传编码的生物学属性。这些变化可以采取删除部分遗传物质、加入外源性遗传物质或者像遗传物质中现有核苷酸序列的替换的变化的形式。

用于真核生物遗传改造的方法为人们所知已超过20年，并且已发现其广泛应用于植物和动物细胞和微生物以改善农业、人类健康、食品质量和环境保护领域。

遗传改造的常见方法由向细胞基因组中加入外源性DNA片段组成，然后这将赋予那种细胞或其有机体除了通过已经现有的基因编码的属性以外的新的属性(包括其中现有基因的表达将因此被抑制的应用)。尽管很多这样的实例可以有效地获得所需的属性，但是这些方法不是非常准确，因为无法控制外源性DNA片段插入其中的基因组位置(并因此无法控制最终的表达水平)，并且因为所需的效果将其自身体现在由原始的且均衡的基因组编码的自然属性之上。遇到的一个常见问题是，由于外源性DNA片段在宿主基因组DNA中的随机整合，必要或有利的基因被失活或修饰，造成宿主所需特征的不必要的损失。

相反，将导致预定义的基因组基因座中核苷酸的加入、删除或转化的遗传改造的方法将允许现有基因的精确改造。

随着过去十年里基因组学的出现，现在有可能迅速且成本有效地地破译动物、植物和细菌的基因组。这已经导致大量的能够与如动物的疾病易感性或植物的产量特征的表型有关的基因和调节序列。这将允许迅速建立序列的假定功能，但是一个基因对一种观察到的表型负责的最终证明必须通过创建显示预期的改变的表型的突变系来获得。

不同于动物细胞，植物细胞由多糖和蛋白质的混合物组成的厚厚的细胞壁包围，而动物细胞可以轻易地服从外来分子的引入，植物细胞更加顽固并且需要稍微更加侵略性的方法。为了向植物细胞中引入外来分子的现有技术程序可以分为2种类别。

第一类重组了采用通过刺穿植物细胞壁向植物细胞中机械引入感兴趣的分子的所有方法。这能够通过生物弹道递送(biolistics delivery)来完成，其中将感兴趣的分子包被在金属珠(金或钨)上，使用气体加压装置将其推进到细胞中。然而，这种方法的效率相当低并且因为不是所有的细胞都被转化，选择是必须的，其限制了目标的数目。另一种方法使用了连接到一个微型操纵器上的微-或纳-针将化合物穿过细胞壁直接注射到植物细胞中。然而，微注射需要特殊设备和大量技巧。该方法同样是单调的和费时的并且相较于生物弹道递送几乎没有提供优势。但另一种方法使用了碳纳米管，其含有感兴趣的分子并且其末端包被有细胞壁消化酶。据说，纳米管将局部地降解细胞壁并刺穿质膜允许其内容物递送进入宿主细胞。虽然与微注射或生物弹道轰击(biolistics bombardment)相比侵略性较低，上述限制也适用于此。

第二类重组了其中在引入感兴趣的分子之前用酶将整个植物细胞壁移除的所有方法。细胞壁的完全移除破坏了细胞之间的联系，产生了个体化细胞的均匀混悬物，其允许更均匀和更大规模的转染实验。这包括，但不仅限于，原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的转染和聚乙二醇介导的转染。因此，原生质体的制备是一种产生数百万细胞的非常可靠和廉价的方法，并且由于其灵活性、效率和产量，通常比其它方法优选。

几乎能够从每一种植物组织中分离原生质体。原生质体的主要来源是叶肉组织，其每克鲜重产生大量的原生质体。其它组织类型的使用主要取决于现有程序对于所考虑的系统和实验最终目标的可用性。