[发明专利]高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及药学方法领域，特别涉及药物筛选，具体是指一种高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法。

背景技术

随着生命科学的迅速发展，人们不仅关注一些常见疾病的治疗，更开始挖掘遗传疾病和衰老的秘密，期待从根本上排除隐患，抵抗衰老。DNA作为携带及传递遗传信息的重要生物分子，其完整性的保持成为生物科学的重点研究领域，各种评价DNA损伤的技术不断进化，寻找高效安全的DNA保护性药物的报道也日益增多。

传统的DNA评价技术如放射元素标记法，高效液相色谱-电化学测量法，气质联用法或高效毛细管电泳法等虽然灵敏度高，但是都存在仪器大型贵重，且需要专业人员护理以及操作过程繁琐的特点；早期被用来定量检测细胞内DNA单链断裂的快速沉降技术、碱性解旋和洗脱技术也因为检测灵敏度低、安全性差和实验周期长等原因难用于高效筛选DNA保护性药物；传统的DNA保护药物的研究往往是在活体或细胞水平上，实验周期较长、对实验设备有较高要求，体外的研究排除杂质对检测的干扰并不简便，因此每项研究一般只能考察少数几种药物的效果。

现有专利中存在一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，该方法如图1、2所示以鸟嘌呤被氧化后产生的8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine,8-OH-dG)为DNA氧化损伤标志物评价药物保护作用，主要包括以下的步骤:1.共价键固定DNA在磁性微球表面；2.加入中草药溶液；体外染毒固定化的DNA；3.磁性分离氧化组分，保留氧化损伤的DNA；4.加入8-OH-dG抗体，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应；5.加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；6.加入发光底物，高灵敏度化学发光法检测DNA损伤产生的8-OH-dG；7.检测结果与对照组的检测结果进行分析，若信号较对照组低则认为中草药具有抑制8-OH-dG产生的功能。其工作原理如图1所示：

由于此技术是以DNA的一种碱基损伤作为检测指标的，故存在以下不足：第一点，据文献报道DNA受到氧自由基攻击不仅产生包括8-OH-dG在内的碱基损伤，其链状结构也会发生断裂，即断链损伤。这即意味着在上述技术体系中实际是存在如下图所示的反应情况的，图中所示的两种情况实际产生的8-OH-dG是同样多的，但由于同时发生了DNA断链，而照上述技术第3步，洗涤磁性微球将保留的待检测8-OH-dG与中草药等杂质分离，同时也与已断下来的部分DNA链分离，产生的8-OH-dG不确定是集中在断掉部分还是保留部分，于是即使是DNA上产生同样多的8-OHdG，检测到的信号却可能相差很大，图1中添加的中草药实际没有抑制8-OH-dG的作用，信号却显示比对照组低很多，于是容易产生“假阳性”的结果。第二点，此技术对DNA损伤的检测需要两步免疫反应，不够简便。

所以一种降低假阳性结果的发生率的，简便灵敏高效的筛选DNA断链损伤保护性药物的方法是十分具有实用价值的。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供了一种可以降低假阳性结果的发生率的，简便灵敏高效的筛选DNA断链损伤保护性药物的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将一端用荧光素FAM修饰另一端用氨基修饰的DNA通过共价键与磁性微球表面固定，得到固定化DNA；

步骤(2)：向所述的固定化DNA中加入药物的溶液，得到具有药物的DNA；

步骤(3)：将所述的具有药物的DNA进行体外染毒，得到染毒DNA；

步骤(4)：将所述的染毒DNA进行磁性分离，分离掉染毒成分和反应杂质，保留未断链DNA；

步骤(5)：向所述的未断链DNA中加入酶标FAM抗体，所述的酶标FAM抗体与未断链DNA自由端的FAM发生免疫反应，得到免疫反应后的DNA；

步骤(6)：向所述的免疫反应后的DNA中加入发光底物后，采用高灵敏度化学发光法检测所述的免疫反应后的DNA，得到检测信号；

步骤(7)：将所述的检测信号与对照组信号进行对比，判断所述的药物是否保护DNA。

较佳地，所述的步骤(1)具体包括以下步骤：

步骤(1.1)：将磁性微球采用羧基修饰，取羧基修饰后的磁性微球用咪唑缓冲液磁性分离法洗涤3次后，分散在溶有EDC的咪唑缓冲液中，37℃恒温振荡20min，得到带有磁性微球的溶液；