[发明专利]一种低pH值胁迫提高ε‑聚赖氨酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种微生物合成分泌的L-赖氨酸同聚物，由25-35个L-赖氨酸残基通过α-羧基与ε-氨基的脱水缩合作用聚合而成。ε-PL具有水溶性好、热稳定性高、可食用、可降解以及对人和环境无毒害等优点。另外，ε-PL还具有广泛的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌等都具有良好的抑制作用。因此，ε-PL作为一种优良的生物食品防腐剂，已相继被日本、韩国以及美国和欧洲等国家和地区批准其在食品加工业中使用。2014年4月，我国食品安全国家标准也批准ε-PL作为食品防腐剂被允许使用。除此之外，作为一种多阳离子生物聚合物，ε-PL还被广泛应用于医药、环境和电子等工业领域。由此可见，ε-PL是一种具有多种用途的重要工业生物技术产品，具有巨大潜在商业价值。

当前，ε-PL生产仅限于利用链霉菌通过液态好氧发酵技术实现。因此，选育高产菌和优化发酵过程就成为提高ε-PL发酵水平的主要途径。基于菌体生长和产物合成需要不同最适pH原则，由Kahar et al.最早提出了两阶段pH值调控方法：发酵周期的前48h维持pH值＞5.0(阶段Ⅰ)，48h后维持pH值4.0左右(阶段Ⅱ)，这种pH值先高后低控制方法结合碳氮源流加技术，实现Streptomyces albulus S410的ε-PL最高产量达到48.3g/L。近年来，发明人以最高ε-PL比合成速率为调控目标，提出了新的两阶段pH值调控方法：发酵前36h维持pH值3.5(阶段Ⅰ)，36h后维持pH值3.8(阶段Ⅱ)，这种pH值先低后高的调控策略，最终实现Streptomyces sp.M-Z18的补料-分批发酵ε-PL产量达到30.11g/L。对比两个pH值调控方法可以发现，它们之间存在明显差异：(1)出发点不同，前者为菌体生长和产物合成分别提供最适pH环境，后者是为了实现产物最大比合成速率；(2)pH值控制策略不同，前者阶段Ⅰ控制的pH值较阶段Ⅱ高，而后者阶段Ⅰ控制的pH值较阶段Ⅱ低。

尽管前面的研究工作成功的通过采用pH调控的方法提高了ε-PL的产量，但是却没有采用极端低pH环境胁迫的方法来提高ε-PL产量。本发明通过极端低pH值胁迫进一步促进ε-PL产量的提高。

发明内容

本发明的目的是通过在ε-PL发酵前期引入极端的酸性pH值胁迫，以提高ε-PL产量。本发明在发酵前期人为或自发地使发酵液pH值从起始7.0下降至2.5—3.0，维持一段时间后，将pH上调至3.5—4.5，维持稳定直到发酵结束。

在本发明的一种实施方式中，在ε-PL发酵开始后，先让发酵液pH自发下降至5.0左右，并控制pH在5.0左右直至菌体量倍增，然后人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后将pH调为3.5-4.5并保持稳定直到发酵结束。

本发明的一种实施方式主要包括以下步骤：(1)将ε-PL产生菌链霉菌的种子液接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(2)当pH从起始的7.0自发下降至5.0时，通过碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直至菌体干重倍增；(3)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降至2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到发酵结束。

本发明的另一种实施方式主要包括以下步骤：(1)将保藏的ε-PL产生菌链霉菌属孢子，接种到M3G培养基中，30℃培养24h作为种子液；(2)将种子液以8％的接种量接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(3)当pH从起始7.0自发下降至5.0时，通过蠕动泵自动添加碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直到菌体干重倍增；(4)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到分批或补料-分批发酵结束。

在本发明的一种实施方式中，所述的ε-PL生产菌还可以是芽孢杆菌属ε-PL产生菌。

在本发明的一种实施方式中，ε-PL的其他发酵条件为：发酵温度30-37℃，通气量为0.5-2vvm，搅拌转速为200-800rpm。

在本发明的一种实施方式中，调节pH的所述的碱溶液为2-4mol/LNaOH或12.5％-25％氨水。

在本发明的一种实施方式中，所述的发酵罐为搅拌式或气升式发酵罐，并且发酵罐体积不限。