[发明专利]一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法

权利要求书

1.一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特征在于，包括如下步骤:

(1)构建CRISPR/Cas9载体系统；

(2)利用构建的CRISPR/Cas9载体系统将目的基因导入受体细胞，剔除β2-微球蛋白基因片段；

(3)对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特征在于，所述步骤(1)中CRISPR/Cas9载体系统，采用如下步骤构建：

B2M基因座外显子2为靶的介导序列和接头序列经过互補黏合后，与BbsI-切刻的pX260-Cas9质粒运载体粘连，在3’端带3bp TGG前间区序列邻近基序(PAM)的B2M特异间隔序列引入载体,所述介导序列和接头序列如下：

5’...G A C A T T G A A G T T G A C T T A C T G A A G A A T G G A G A G A G...3’

3’...C T G T A A C T T C A A C T G A A T G A C T T C T T A C C T C T C T C...5’

产生的U6-B2M-crRNA构件随后从质粒通过PCR扩增并插入EcoRI和Xhol之间以使用GeneArt基因生成形成pFB-U6-B2M-crRNA质粒；

为了制备pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA质粒，人源化的Cas9和px260-Cas9质粒中的CBh启动子被PCR扩增成两个各2.8kb的片段；采用双重粘连法，两个片段被同时用BamHI、Xhol、HindIII限制点亚克隆为pFastBac1；然后再插入从pX260-Cas9质粒得到的H1-tracrRNA；最后，px260-Cas9中原始的U6-hEMXcrRNA片段通过Xbal和BamHI消化被移除；Xbal和BamHI继续悬挂于用PCR扩增处理过的小片段，有互补Xbal和BamHI悬挂的质粒上；

为了制备供体质粒pFB-B2M-eGFP，属于B2M基因座的一条636-bp左同源臂和一条687-bp的右同同源臂由U87细胞基因组DNA扩增得来，然后被插入pFB-PGK-Neo-EGFP-LoxP，一个pFastBac1载体通过SnaBI/Sall供左同源臂以及Notl/BstBI供右同源臂已于之前制成；

重组的杆状病毒载体(BV)，包括BV-B2M-crRNA、BV-Cas9/tracrRNA和BV-B2M-eGFP，用以上pFB-U6-B2M-crRNA,、pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA和pFB-B2M-eGFP质粒分别生成，并依据Invitrogen Bac-to-Bac杆状病毒表达系统协议在Sf9昆虫细胞中增殖。

3.根据权利要求1所述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特征在于，步骤(3)中通过流式细胞分析法、蛋白质印迹法、免疫荧光染色法对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。

4.根据权利要求1所述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特征在于,还包括免疫反应化验步骤，使用Elipost化验法对转染后的受体细胞进行免疫反应化验。