[发明专利]一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，特别涉及一剔除β2-微球蛋白基因片段的遗传工程方法。

背景技术

β2-微球蛋白(B2M)是人类白细胞抗原Ⅰ类分子(HLA-I)复合体的一个组成部分,与HLA-I分子在细胞表面的表达以及细胞免疫源性密切相关。位于第6对染色体短臂的人类白细胞抗原系统(HLA)是目前所知的最具多态性的遗传系统。它们编码了第一型和和第二型的细胞表面分子。HLA第一型分子在所有有核细胞表面都有表达，用于呈现细胞内来源的肽，调节先天免疫和获得性免疫。HLA第一型分子在细胞表面的表达取决于是否能适当地和β2-微球蛋白(B2M)结合成为一个复合体。人B2M分子质量为11.6kDa，含99个氨基酸。人B2M基因由3个外显子组成。

通过剔除B2M基因，改变细胞表面HLA第一型分子表达，产生低免疫源性的小鼠和人细胞以前已被测试过(Zijlstra et al.,1990,2010；Matin et al.,2004；Zafarana et al.,2009；Riolobos et al.,2013；Torikai et al.,2013；Lu et al.,2013；Figueiredo et al.,2014)。在80年代，采用了经典同源重组法剔除小鼠胚胎干细胞中的B2M基因，随后用这些干细胞产生嵌合鼠，再通过杂交来产生B2M阴性鼠(Koller et al,1989；Zijlstra et al.,1989，1990，2010)。B2M-/-鼠不表达任何可测量水平的B2M蛋白，几乎完全缺失细胞表面正常工作的第一型MHC抗原，但是他们是健康的。经典的同源重组法进行基因打靶的效率很低，现在已少用。在人胚胎干细胞中，RNA干扰(RNAi)对B2M转译的抑制已有测试(Matinet al.,2004；Zafarana et al.,2009)。但是，RNAi有一些缺点，如剔除不完全，以及潜在的非特异性。一份最近的研究已经证明了AAV载体引入一个结束密码子到B2M基因中可提前结束B2M基因表达(Riolobos et al.,2013)。通过电穿孔方法在人胚胎干细胞中介入锌指核酸酶(ZFN)mRNA已用于干扰HLA第一型分子表达(Torikai et al.,2013)。转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)也已用于在人胚胎干细胞中干扰B2M基因表达(Lu et al.,2013)。

ZFN和TALEN是两种早期的使用定制DNA核酸内切酶进行基因组编辑的方法，制作比较繁琐，用起来较贵。特别是TALEN分子比ZFN大得多，因此很难高效导入细胞，比如人胚胎干细胞。使用核酸内切酶进行基因组编辑的新生力量是所谓的成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统。这一系统带来了很多好处：简单、灵活，价格低廉、易于编程且非常高效(Hsu et al.,2014)。CRISPR/Cas9系统以RNA介导方式瞄准一段特定的DNA序列。这项技术使用一段无编码的介导RNA(gRNA)，gRNA由目标特定CRISPR RNA(crRNA)和一个支架反式激活crRNA(tracrRNA)来介导Cas9核酸酶至一个特定的基因组目标，引发DNA双链断裂(DSB)。后续的非同源末端连接(NHEJ)激活或同源重组修复使在目标位置的基因干扰，修正和插入成为可能。

采用同源重组的基因靶向仍然是一个应用广泛的让选定的DNA序列以一个事先决定的方式被修改的技术，但是有耗时费力的不利因素。ZFN和TALEN技术可以在选定的基因组位点引入DNA DSB以刺激容易错误的NHEJ或同源重组修复，因此增加了基因修改的效率。

发明内容

为了解决上述剔除β2-微球蛋白基因片段过程中的缺陷，本发明公开一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，本发明采用如下技术方案来解决上述技术问题：

一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，包括如下步骤:

(1)构建CRISPR/Cas9载体系统；

(2)利用构建的CRISPR/Cas9载体系统将目的基因导入受体细胞，剔除β2-微球蛋白基因片段；

(3)对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。

优选的，在上述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法中，所述步骤(1)中CRISPR/Cas9载体系统，采用如下步骤构建：

B2M基因座外显子2为靶的介导序列和接头序列经过互補黏合后，与BbsI-切刻的pX260-Cas9质粒运载体粘连，在3’端带3bp TGG前间区序列邻近基序(PAM)的B2M特异间隔序列引入载体,所述介导序列和接头序列如下：