[发明专利]一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法

权利要求书

1.一种检测样品中具有雌激素效应的化合物浓度的方法，包括如下步骤：

（1）建立雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线，包括如下步骤：

A1、制备双杂交酵母菌处于对数生长期的双杂交酵母菌液；

B1、将雌激素化合物溶液与步骤A1的双杂交酵母菌液按照同一体积比混匀，制备成雌激素化合物各暴露液，使得雌激素化合物各暴露液中的所述双杂交酵母菌含量均相同，雌激素化合物含量均不同；将二甲基亚砜与步骤A1的双杂交酵母菌液混匀，制备成二甲基亚砜暴露液，使得二甲基亚砜暴露液中的所述双杂交酵母菌含量与所述雌激素化合物各暴露液中的所述双杂交酵母菌含量相同；将所述雌激素化合物各暴露液和所述二甲基亚砜暴露液分别进行相同的暴露培养，对应得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亚砜暴露后溶液，检测所述雌激素化合物各暴露后溶液在600nm处的吸光度值OD₆₀₀；

C1、分别取所述雌激素化合物各暴露后溶液或所述二甲基亚砜暴露后溶液，向其中加入测试缓冲液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液，反应，再加入碳酸钠水溶液中止反应，得到对应的雌激素化合物各中止反应溶液和二甲基亚砜中止反应溶液，分别取其上清液检测420nm处的吸光度值OD₄₂₀，按照公式1对应得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亚砜暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性：

U = (OD_420s − OD_420b) × D / (t × V × OD₆₀₀)（公式1）

公式1中， U为暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性；

OD_420s为雌激素化合物各中止反应溶液的上清液在420nm处的吸光度值；

OD_420b为二甲基亚砜中止反应溶液的上清液在420nm处的吸光度值；

D为稀释因子，即雌激素化合物中止反应溶液的体积与步骤C1所取的雌激素化合物各暴露后溶液的体积比，将该体积比命名为D_雌；或，二甲基亚砜中止反应溶液的体积与步骤C1所取的二甲基亚砜暴露后溶液的体积比，将该体积比命名为D_砜；所述D_雌等于D_砜；

t为从加入所述测试缓冲液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液后至加入碳酸钠水溶液中止反应之间的时间；

V为检测420nm处的吸光度值OD₄₂₀时所取的上清液体积；

OD₆₀₀为雌激素化合物各暴露后溶液在600nm处的吸光度值；

D1、按照公式2得到雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率：

诱导率% = U_s / U_p × 100（公式2）

公式2中，U_s 和U_p分别为雌激素化合物各暴露后溶液和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性；

所述阳性对照为雌激素化合物含量为K的雌激素化合物暴露液经所述暴露培养后得到的暴露后溶液，雌激素化合物含量为K的雌激素化合物暴露液是将雌激素化合物溶液与步骤A1的双杂交酵母菌液按同一体积比混匀得到的液体；K为以雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量为横坐标，以公式1得到的雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性为纵坐标，制成的雌激素化合物的浓度—β-半乳糖苷酶活性曲线的第二个拐点处对应的雌激素化合物的浓度；

E1、以所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量为横坐标，以公式2得到的雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，制作雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线，并得到如下公式3：

E_induction = f_E(x_E2)（公式3）

公式3中，E_induction为雌激素化合物各暴露后溶液的的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率；

f_E 中的下标_E代表雌激素；

x_E2为所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量；

（2）检测待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，包括如下步骤：

根据步骤（1）得到待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率；

（3）得到待测样品的雌二醇当量E2-EQ_bio，包括如下步骤：

采用公式9得到待测样品的雌二醇当量E2-EQ_bio：

E2-EQ_bio = f_E^-1 (E_induction) / cf（公式9）

公式9 中f_E^-1 (E_induction)为公式3的反函数；

f_E^-1中的下标_E代表雌激素；

E_induction为待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率；

cf为待测样品到原始样品的浓缩倍数；

（4）确定待测样品的雌激素受体拮抗物当量OHT-EQ_bio，包括如下步骤：

A4、建立雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线，建立雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的方法与步骤（1）的建立雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线的方法区别仅在于将雌激素化合物替换为雌激素受体拮抗物；

B4、按照公式4得到雌激素受体拮抗物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率：

抑制率% = (1 – U_s / U_p) × 100（公式4）

公式4中，U_s 和U_p分别为雌激素受体拮抗物各暴露后溶液和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性；

C4、以雌激素受体拮抗物各暴露液的雌激素受体拮抗物含量为横坐标，以公式4得到的雌激素受体拮抗物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，制作雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线，并得到如下公式5：

E_inhibition = f_O(x_OHT)（公式5）

公式5中，E_inhibition为β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率；

f₀ 中的下标₀代表雌激素受体拮抗物；

x_OHT为雌激素受体拮抗物各暴露液的雌激素受体拮抗物含量；

D4、将雌激素化合物溶液A和待测样品共同替换步骤（1）中的雌激素化合物溶液，作为混合组，雌激素化合物溶液A与混合组暴露液中的双杂交酵母菌液的体积比与待测样品与混合组暴露液中的双杂交酵母菌液的体积比相同，且均与步骤（1）B1中的所述体积比一致，混合组暴露液中的雌激素化合物在加入雌激素化合物溶液A而未加待测样品时的暴露液中的浓度与所述阳性对照对应的雌激素化合物暴露液中的雌激素化合物浓度相同，其余步骤不变，按照步骤（1）得到混合组各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性；

E4、按照公式4得到混合组各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率；

F4、采用公式11得到待测样品的雌激素受体拮抗物当量OHT-EQ_bio：

OHT-EQ_bio = f_O^-1 (E_inhibition) / cf（公式11）

公式11中，f_O^-1 (E_inhibition)为公式5的反函数；

f₀ 中的下标₀代表雌激素受体拮抗物；

E_inhibition为待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率；

cf为待测样品到原始样品的浓缩倍数；

（5）利用公式12对E2-EQ_bio进行修正，得到修正后待测样品中具有雌激素效应的化合物的浓度：

E2-EQ_bio*= {EC₅₀(OHT) × E2-EQ_bio + [(EC₅₀(OHT) × E2-EQ_bio)^2 + 4 × EC₅₀(E2) × EC₅₀(OHT) × E2-EQ_bio ×OHT-EQ_bio]^0.5} / 2 × EC₅₀(OHT)（公式12）

公式12中，EC₅₀(OHT)为步骤（4）中C4得到的雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的雌激素受体拮抗物的半数效应浓度，EC₅₀(E2)为步骤（1）得到的雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线的雌激素化合物的半数效应浓度；

所述双杂交酵母为发明名称为“用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法”，授权公告号为 CN101469315B的发明专利中权利要求1-3任一所述的双杂交酵母；

所述测试缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl、MgSO₄·7H₂O、十二烷基磺酸钠和β-巯基乙醇；所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为16.1 g/L ，所述NaH₂PO₄·H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为5.5 g/L，所述KCl在所述测试缓冲液中的浓度为0.75 g/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为0.246 g/L，所述十二烷基磺酸钠在所述测试缓冲液中的浓度为0.333 g/L，所述β-巯基乙醇在所述测试缓冲液中的浓度为2.7 mL/L；

所述β-半乳糖苷酶底物溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl和MgSO₄·7H₂O；所述邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为13.3mmol/L、所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为16.1 g/L、所述NaH₂PO₄·H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为5.5 g/L、所述KCl在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为0.75 g/L、所述MgSO₄·7H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为0.246 g/L。