[发明专利]一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法，属于生物技术领域。

背景技术

雌激素受体干扰物是内分泌干扰物研究的热点之一，水环境中的雌激素受体干扰物包括来源于各种渠道的天然雌激素和其他类/抗雌激素物质。它们在较低的暴露浓度下就会造成生物体的不良影响，而环境中的联合暴露往往意味着加和甚至相互作用的可能性。因此监测雌激素受体干扰物的环境水平及其对生物的不良影响是非常重要的。

许多机构和组织——包括美国环境署、美国健康与公共事业部、经济合作与发展组织等——都提出了检测雌激素效应的生物测试方法清单。与化学分析相比，生物检测方法可以提供雌激素诱导/拮抗效应的整体信息，也更利于综合判断和毒性评估。雌激素受体在雌激素效应的发挥上起到重要作用，因此清单中大多数方法都与雌激素受体相关，鼓励使用受体方法检测雌激素类物质。其中，双杂交技术重组人雌激素受体的酵母测试方法已被应用于各种环境水样的检测，具有灵敏度高、重现性好、操作简便、成本低廉等优点。共激活因子的引入使双杂交酵母与活体测试结果有更好的吻合度。例如，单杂交酵母测试结果显示合成雌激素17α-乙炔基雌二醇的雌激素效应弱于天然雌激素17β-雌二醇(Van den Belt K,et al.Aquat.Toxicol.2004,66(2):183-195)；但虹鳟和双杂交酵母作为受试生物时，17α-乙炔基雌二醇的雌激素效应都被证明比17β-雌二醇更强(Thorpe KL,et al.Environ Sci Technol.2003,37(6):1142-1149；Yang R,et al.Environ.Toxicol.Pharmacol.2014,38(3):829-837)。

上述双杂交酵母测试的工作原理是：天然或环境雌激素可与雌激素受体结合并导致其构象改变，此时的配体—受体复合物可在细胞核内进一步结合共激活因子，启动下游报告基因的转录。然而，雌激素受体拮抗物的存在会干扰这一过程，从而造成对雌激素诱导效应的测试结果的低估。目前，研究多集中在(类)雌激素混合物的联合作用上，而较少关注类雌激素和雌激素受体拮抗物的联合作用。但在某些环境样品中(如医院废水、药厂废水等)，雌激素受体拮抗物可以达到较高的浓度，其造成的效应需要研究者给予重视。这时，生物测试结果描述的是两类物质共同作用的联合效应，而不能利用此效应大小反推真实的雌激素物质水平。因此，对这种干扰甚至掩蔽作用加以关注和评估在污染物毒性评价方面具有现实意义。

综上所述，真实环境中有复杂的类雌激素和雌激素受体拮抗物共同存在。在某些废水中高浓度的雌激素受体拮抗物足以影响生物测试方法对雌激素效应的检测，但这一点在实际研究中较少受到关注，相关信息和结果较少。因此，需要建立一种方法计算并修正化学混合物及环境样品(可看作复杂混合物)中的雌激素受体拮抗物对使用双杂交酵母方法检测出的雌激素受体诱导效应的干扰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是检测样品中的天然雌激素化合物或类雌激素化合物的浓度。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测样品中具有雌激素效应的化合物浓度的方法，包括如下步骤：

(1)建立雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线，包括如下步骤：

A1、制备双杂交酵母菌处于对数生长期的双杂交酵母菌液；

B1、将雌激素化合物溶液与步骤A1的双杂交酵母菌液按照同一体积比混匀，制备成雌激素化合物各暴露液，使得雌激素化合物各暴露液中的所述双杂交酵母菌含量均相同，雌激素化合物含量均不同；将二甲基亚砜与步骤A1的双杂交酵母菌液混匀，制备成二甲基亚砜暴露液，使得二甲基亚砜暴露液中的所述双杂交酵母菌含量与所述雌激素化合物各暴露液中的所述双杂交酵母菌含量相同；将所述雌激素化合物各暴露液和所述二甲基亚砜暴露液分别进行相同的暴露培养，对应得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亚砜暴露后溶液，检测所述雌激素化合物各暴露后溶液在600nm处的吸光度值OD₆₀₀；

C1、分别取所述雌激素化合物各暴露后溶液或所述二甲基亚砜暴露后溶液，向其中加入测试缓冲液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液，反应，再加入碳酸钠水溶液中止反应，得到对应的雌激素化合物各中止反应溶液和二甲基亚砜中止反应溶液，分别取其上清液检测420nm处的吸光度值OD₄₂₀，按照公式1对应得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亚砜暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性：