[发明专利]检测血清中NOX1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、评估高血糖人群并发肠癌易感性的试剂盒及评估方法

权利要求书

1.检测血清中NOX1 mRNA转录水平的RT-PCR引物，其特征在于：

引物F：5’-ATAGCAGAAGCCGACAGG-3’；

引物R：5’-CCAGTGAGACCAGCAATG-3’。

2.检测血清中NOX1 mRNA转录水平用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的RT-PCR引物。

3.根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于还包含内参引物，所述内参引物如下：

引物F：5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'；

引物R：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。

4.根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于还包含RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR反应液；

所述RNA提取试剂的组分及浓度如下：Trizol试剂355～800ml、氯仿200～400μL、异丙醇600～1000μL、无水乙醇1.75～5.00mL、DEPC水290～1000μL；

所述逆转录试剂组分及浓度如下：150～250U/μL逆转录酶2μL、4～6×逆转录缓冲液4μL、12～50 mmol/L dNTPs 4μL、0.1～1.2mol/L DTT 2μL、35～45U/μL RNA酶抑制剂0.5μL；

所述PCR反应液组分及浓度如下：Syber GreenⅠ荧光核酸染料25μL、DNA聚合酶100U/ml、dNTPs 0.2 mmol/L、氯化镁6 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5 mmol/L、氯化钾89.3 mmol/L、DEPC水50μL～60μL。

5.根据权利要求4所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于所述Trizol试剂具体为：重蒸苯酚200mL、8-羟基喹啉0.2g 、β- 巯基乙醇1.2g /二硫苏糖醇0.5g 、异硫氢酸胍100g 、蒸馏水118mL 、0.75M 柠檬酸钠7.04mL 、10％十二烷基肌氨酸钠10.56mL和2M 醋酸钠20mL。

6.根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于逆转录反应体系如下：

引物F                     1μL、

引物R                     1μL、

RNA模板                  2μL、

逆转录酶                  2μL、

5×逆转录缓冲液          4μL、

25mM  dNTPs             4μL、

0.1 M  DTT                2μL、

RNA酶抑制剂              0.5μL

DEPC水 余量

总体积                20μL。

7.根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于扩增体系如下：

引物F                     1μL、

引物R                     1μL、

cDNA模板                 2μL、

SYBR Green I荧光核酸染料   2μL

DEPC水                   余量

总体积                50μL。

8.通过检测血清中NOX1 mRNA转录水平来评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法，包括以下步骤：

血清总RNA的提取

收集评估对象的清晨空腹外周静脉血5ml，置于冷冻离心机中，4℃下调整转速2500-3000 r/min，离心8-10min后用无菌吸管吸取血清2 ml～3ml；

将上述血清加入含有1mL Trizol试剂的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上；

置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min；

吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min；

吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清；

加入1mL75%的无水乙醇漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；所述75%的无水乙醇的组成为750μL无水乙醇+250μL DEPC水；

加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；

加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用；

逆转录合成cDNA

采用权利要求6所述的RT-PCR试剂盒进行逆转录，反应程序：42℃，50min；85℃，5min；反应结束后离心，置于-20℃保存；

Real-time PCR扩增

采用权利要求7所述RT-PCR试剂盒进行扩增，反应程序如下：95℃ ，10min；95℃，15 Sec； 60℃，1min；95℃，15 Sec；60℃，15 Sec；

验证目的基因表达

分析统计NOX1 mRNA的相对表达量，采用SDS 2.3软件分析结果，Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中NOX1 mRNA 相对表达量；计算2^(-△Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，△Ct是同一个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2^(-△Ct)换算成基因表达量；以样本2的2^(-△Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19.0统计软件，计数数据以均数±标准差                                               表示；以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著统计学意义。