[发明专利]基于DNA条形码的烟草虫害检测方法

权利要求书

1.一种基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：该检测方法是利用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取可能含有害虫的烟草基因组DNA，使用动物特异性的DNA条形码（CO1基因）引物进行PCR扩增；如果样品中含有害虫，那么使用CO1特异性引物就能够扩增出相应的目的条带，将特异性PCR产物克隆测序，并通过Blast验证其是否为虫子的DNA条形码基因，即根据PCR条带有无，判断样品中有无害虫；根据目的条带序列，判断是什么害虫。

2.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：该检测方法的具体步骤如下：

（1）收集有害虫的烟草样品，每份样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复；

（2）将各样品分别放入研钵中，倒入20 ml液氮研磨，使用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；

（3）测定各样品基因组DNA的浓度和纯度；

（4）利用动物特异性的CO1条形码基因引物，上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’进行PCR扩增；

（5）将特异性的PCR产物胶回收，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序；

（6）测序结果通过Blast比对，以确定是否为虫子的CO1条形码基因。

3.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：步骤（1）中以无任何虫害的烟草样品作为阴性对照。

4.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：步骤（4）中，PCR反应体系如下（以50 μL反应体系为例）：

PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共运行35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。

5.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：在步骤（5）中，如果PCR扩增出700 bp左右的特异性条带，将该目的条带胶回收，与T载体连接，转化感受态细胞，随机挑取10个单克隆进行测序。

6.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：步骤（6）中，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，如果与数据库中某个虫子的CO1条形码基因序列的相似度在95%以上，则表明待测的烟草样品中含有虫子，同时还可以确定虫子是哪个物种。