[发明专利]基于DNA条形码的烟草虫害检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可准确地检测烟草虫害的基于DNA条形码的检测方法。

背景技术

烟草在加工、储藏和销售等过程中均易遭受害虫破坏，害虫/虫尸混入烟叶和卷烟产品中，会降低烟叶及烟丝的品质，劣化卷烟的吸味。据调查，全国贮烟害虫每年导致的烟叶重量损失率大约为1.64％，烟叶损失总量大约为62.3万担。目前烟草行业对烟草虫害的检测主要分为肉眼检查和信息素诱集检测。前者受人为因素影响太大，准确度不高；后者只能诱集到活的成虫，对死虫、虫卵、幼虫或虫蛹等无效，这些虫源“污染”同样会给烟叶贮存和卷烟生产带来危害。

2003年，加拿大分类学家Paul Hebert提出了DNA条形码的概念，它是基因组DNA中的一个特殊的小片段基因序列，相当于物种的基因身份证，通过它可以区分不同的物种，其中线粒体CO1基因作为动物DNA条形码应用相当广泛。Paul Herbert等人利用CO1基因研究了动物界的11个门，13320个物种，除了刺胞动物门以外，CO1都能够很好地区分其它门的物种。

由于烟草属于植物界，因此利用CO1条形码基因的特异性引物无法从烟草基因组DNA中扩增出相应的目的条带。如果烟草中混有虫体的话，提取的烟草基因组DNA中就会含有虫体的DNA，使用CO1引物进行PCR扩增时，就能够扩增出动物的DNA条形码基因。

发明内容

本发明的目的是针对烟草行业现行的烟草虫害检测方法的缺陷与不足，提供了一种科学准确的分子生物学检测方法——基于DNA条形码的烟草虫害检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，是利用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取可能含有害虫的烟草基因组DNA，使用动物特异性的DNA条形码（CO1基因）引物进行PCR扩增；如果样品中含有害虫，那么使用CO1特异性引物就能够扩增出相应的目的条带，将特异性PCR产物克隆测序，并通过Blast验证其是否为虫子的DNA条形码基因，即根据PCR条带有无，判断样品中有无害虫；根据目的条带序列，判断是什么害虫，具体步骤如下：

（1）收集有害虫的烟草样品，每份样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复；

（2）将各样品分别放入研钵中，倒入20 ml液氮研磨，使用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；

（3）使用超微量分光光度计Thermo NanoDrop 2000测定各样品基因组DNA的浓度和纯度；

（4）利用动物特异性的CO1条形码基因引物（上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’）进行PCR扩增；

（5）将特异性的PCR产物胶回收，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序；

（6）测序结果通过Blast比对，以确定是否为虫子的CO1条形码基因。

步骤（1）中以无任何虫害的烟草样品作为阴性对照。

步骤（4）中，PCR反应体系如下（以50 μL反应体系为例）：