[发明专利]一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。

背景技术

胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)寄主繁多，有2200多种植物，引起炭疽病，给农业生产造成严重的经济损失^[1]。胶孢炭疽菌侵染大豆植株时，大豆的茎、荚、叶及叶柄均可受害，并且可以导致大豆种子品质降低。发病植株茎秆病斑深灰色，黑色小点排列不规则；荚上病斑不规则形，褐色至灰白色，上面密生呈轮纹状排列的小黑点；叶部病斑褐色，产生明显凹陷，一般呈轮纹状排列^[2]。胶孢炭疽菌分生孢子产生在有黏质的分生孢子盘上，分生孢子单细胞，长椭圆形，无色，盘的四周有褐色刚毛^[3]。病原菌主要以菌丝体或分生孢子在落叶或残留的病组织中越冬，越冬病原菌于次年产生分生孢子传播扩散，传播的主要途径是昆虫和风雨传播^[4]，同时，该病菌亦可随大豆种子调运进行跨区域远距离传播。为了阻止大豆胶孢炭疽病菌传播范围的不断扩大，使大豆胶孢炭疽病菌病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。

近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆炭疽病的发生呈扩大蔓延、加重危害的趋势，全国各大豆产区均有炭疽病的发生，对大豆生产造成很大威胁。为了减少大豆炭疽病传播范围的不断扩大，使大豆炭疽病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测，以实现田间早期诊断。

大豆炭疽病可由多种炭疽菌侵染引起，迄今中国已报道引起大豆炭疽病的炭疽菌有胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、平头炭疽菌(C.truncatum)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)、辣椒炭疽菌(C.capsici)、黑线炭疽菌(C.dematium)等。其中，胶孢炭疽菌是炭疽菌属内最大的一个种^[5]，因此针对大豆胶孢炭疽菌的分子检测我们进行了一系列的研究。

传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等^[6]，但炭疽菌种间甚至种内菌株间形态变异大，近似种之间的分类特征差异微小，造成该属的分类较难操作。胶孢炭疽菌作为该属内一个主要种和重要种，从形态特征来看，具有集合种群和复合种的特征，种内菌株间变异大，有多个专化型或生理小种。由于种内菌株从形态至生理特性存在较大的变异性，使该种在鉴定上常与一些近似种混淆，为此类病害的有效防治带来很多困难和问题。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰^[7]，不能在病害潜伏期和初 发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到胶孢炭疽菌的研究中。上世纪80年代发展起来的普通PCR的方法已经成功用于检测胶孢炭疽菌^[8]，但普通PCR已属较陈旧的技术且具若干缺陷，例如检测耗时偏长，大概6～8h；对靶基因区段的识别位点少，误检率偏高，检测特异性与灵敏度偏低；检测过程较繁琐等，难以满足需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增技术^[9]，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，60min左右即可观察结果，具有操作简单、快速、特异性强、产物检测便捷等特点。LAMP反应只需进程结束后，在反应液中加入荧光染料SYBR Green I观察颜色和荧光变化便可直接判断结果，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。SYBR Green I只能结合到双链DNA的小沟部位，当SYBR Green I与双链DNA结合的时候，会发出比原先强800-1000倍的荧光，在日光灯下通过肉眼即可观察到颜色变化。如果含有扩增产物，反应混合物变为黄绿色；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。此外，由于核酸是在恒温条件下进行扩增，因此可以在简单的水浴锅或保温瓶条件下完成实验，不需要购置昂贵的PCR仪，检测成本有所降低，易于在基层部门推广应用。随着技术的不断完善和发展，会在病害检测、食品检测、临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景^[10,11]。