[发明专利]基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途

说明书

技术领域

本发明属于DNA测序技术领域，具体涉及一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，即“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3ˊ-羟基阻断外，为了不影响下一个标记核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可剪切的连接单元把核苷酸和荧光素连接起来。然后，在下一个标记核苷酸并入之前，在温和条件下使该连接单元断裂，实现DNA链的延伸，从而读出DNA碱基序列。该连接单元的性能对DNA测序的读长和效率有至关重要的影响。因此，人们一直致力于发展新的可剪切连接单元，以提高DNA测序的效率。目前已有文献报道的连接单元有还原敏感型(二硫键和偶氮化合物)；光敏感(邻硝基苄基醇,苯甲酰甲基酯衍生物及其它连接单元)；亲电子试剂/酸敏感型；金属剪切型以及氧化剂敏感等。

而现有的可剪切连接单元存在剪切条件不够温和、效率不高，用于测序时读长太短等诸多缺点。因此，设计、合成新的可剪切连接单元，并探索合适的剪切条件对提高测序效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。偶氮化合物在偶氮还原酶或者连二亚硫酸钠等还原剂作用下可以实现快速、完全剪切，相比酸敏感连接单元，还原剂对DNA链没有任何损伤，在具体的实验过程中，只需要通过调节还原剂的用量即可很方便地调节剪切速度。目前关于偶氮化合物作为连接单元应用于DNA测序的报道很少，所以设计、合成基于偶氮连接单元的可逆终端并用于DNA测序具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供基于偶氮连接单元可逆终端的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的基于偶氮连接单元的可逆终端，该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的巨大潜力。所以，基于偶氮结构的可逆终端在DNA测序体系中能够提高测序效率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸，其结构式如式VI所示：

其中，荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种；R₁、R₂、R₃、R₄、R₆为各种取代基，R₅为除-C₂H₅以外的取代基、且R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆不同时为H；n为0～10的整数。

作为优选方案，所述R₁为-H，R₂为-H、-COOH或-COOMe，R₃为-H，R₄为-OH，R₅为-H，R₆为-H或-OH。

作为优选方案，其结构如式VII、式VIII或式IX所示：

第二方面，本发明提供了一种如所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸的制备方法，其包括如下步骤：