[发明专利]一种双特异性抗体EpCAM×CD3的构建及应用

权利要求书

1.双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞是EpCAM,抗-EpCAM重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-EpCAM的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力,氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元的CH2结构域位于scFv片段和CH3结构域之间；不包含CH1结构域。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元构建顺序为“VH-连接肽-VL-Fc”。

4.权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：抗-EpCAM重链在223位点上的半胱氨酸与抗-EpCAM的轻链220位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EpCAM重链在229和232位点上的半胱氨酸与抗-CD3 ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EpCAM重链在395和412位点上与抗-CD3 ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EpCAM重链在369位点上与抗-CD3 ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

5.制备权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；所述的细胞是CHO-S细胞；所述的分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

6.根据权利要求5所述的方法，所述的第一表达载体是pCHO1.0；所述的第二表达载体是是pCHO1.0-潮霉素。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤(1)中：

所述单价单元为抗-EpCAM抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V)F、MK-前导序列(EcoRV)F、M701-VL F1和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-前导序列(AvrII)F、M701-VH F1和hIgG1(sbfI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EpCAM的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW；

所述单链单元为抗-CD3 ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(AvrII)F、MK-前导序列(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1和hIgG1(sbfI)R，通过重叠PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3 ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。

8.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体或者按照权利要求5-7中任一项制备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗EpCAM特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EpCAM细胞。

9.权利要求1-4中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求5-7中任一项制备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的双抗体药物或者评价用于治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的双抗体药物的药效。