[发明专利]一种双特异性抗体EpCAM×CD3的构建及应用

说明书

本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元针对肿瘤细胞表面抗原EpCAM具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(scFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途。

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法，以及双抗体功能及性质检测方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。然而，在双特异性抗体药物研发过程中，普遍存在着表达困难、产量低、纯化难、稳定性差等诸多障碍，因此，构建新的双特异性抗体，使其能克服上述障碍，并建立相应的免疫杀伤动物模型，是非常有必要的。本发明提供了一种新型双特性抗体的构建，并描述了对其药效学的研究方法及结果。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4种亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibi lity complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.EpCAM

EpCAM(CD326)是I型跨膜糖蛋白，作为上皮细胞的特异性细胞粘附分子。它还涉及到其他一些过程，包括细胞迁移，增殖，分化等。EpCAM是最早应用单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗原之一，它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞间同型黏附功能,据此可归入粘附分子家族。EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与包括细胞与基质的相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时,EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达,提示其与肿瘤密切相关。病理情况下，EpCAM不同程度的表达于腺癌中，包括结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。多项研究已证实EpCAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关(见表1)。单特异性抗EpCAM单克隆抗体(MAB)，例如单抗17-1A(glaxowellcome，Centocor)，是第一个批准德国EpCAM导向治疗结直肠癌的辅助治疗，然而，大量的临床用药数据显示，这种单特异性抗体与化疗相比没有明显的更加有益的效果。目前，一些其他的EpCAM定向治疗，包括双特异性抗体，正在发展为癌症治疗的方向，双特异性抗体MT110和Catumaxomab都是针对肿瘤抗原EpCAM的治疗性双抗体药物，其中Catumaxomab已于2009年由欧盟批准用于治疗恶性癌性腹水，MT110已在临床研究中。显然，EpCAM已成为目前肿瘤治疗研究的热点靶标之一。