[发明专利]肝癌干细胞的分离方法

权利要求书

1.一种肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将肝癌细胞用DMEM高糖培育基进行培养；

2)将步骤1得到的肝癌细胞培养液进行消化传代；

3)取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞，用流式分选荧光抗体CD90和CD24进行标记，然后用流式细胞仪分选，CD90和CD24都标记上的CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞。

2.如权利要求1所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤3中对肝癌细胞进行荧光抗体CD90和CD24标记的方法为：取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋酶消化至细胞脱落后用PBS洗涤，过40μm细胞尼龙滤网，肝癌细胞数量控制在1～5×10⁷个/mL，将细胞转入流式细胞仪的流式管中，离心弃掉上清液，加入FACS分选缓冲液重悬，混匀后加入FCR Blocking试剂，室温孵育，加入40-60μL PBS缓冲液后加入4-6μL流式分选荧光抗体CD90和CD24，混匀，5℃避光孵育40-50min。

3.如权利要求1或2所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤1中肝癌细胞的培养方法为将肝癌细胞用含80-100u/mL的青霉素和链霉素的10％胎牛血清的DMEM高糖培育基在37℃、85-95％相对湿度、4-6％CO₂的培养箱中培养。

4.如权利要求1或2所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤2中肝癌细胞的消化传代方法为当细胞覆盖率达80-90％时将步骤1得到的肝癌细胞培养液吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋白酶消化至细胞脱落，终止消化，传代。

5.如权利要求1所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。

6.如权利要求2所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。

7.如权利要求3所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。

8.如权利要求4所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。