[发明专利]肝癌干细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离方法，具体涉及一种肝癌干细胞的分离方法。

背景技术

目前认为肿瘤细胞具有异质性(heterogeneous)，其中少量癌干细胞，表现出更强的生长增殖、致瘤性和对抗肿瘤药物的耐受能力，是肿瘤形成和维持以及治疗后复发的源头细胞，找到这些细胞并确定其细胞生物学特点有助于发展新的诊疗方案实现恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗方案，降低其发生率和致死率。

寻找和鉴定特异性的肝癌干细胞(Liver Cancer Stem Cells，LCSCs)表面标志物是证明肝癌存在的首要环节，对于深入了解肝癌的生物学行为并开展新的靶向治疗研究有着重要意义。目前，LCSCs标志物的研究还只局限于从正常肝干/祖细胞的表面标志物去推定，尚缺乏特异性标志物来鉴定和分离LCSCs。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的肝癌干细胞的分离方法。

本发明实现其目的的技术方案如下：一种肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将肝癌细胞用DMEM高糖培育基进行培养；

2)将步骤1得到的肝癌细胞培养液进行消化传代；

3)取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞，用流式分选荧光抗体CD90和CD24进行标记，然后用流式细胞仪分选，CD90和CD24都标记上的CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞。

所述步骤3中对肝癌细胞进行荧光抗体CD90和CD24标记的方法为：取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋酶消化至细胞脱落后用PBS洗涤，过40μm细胞尼龙滤网，肝癌细胞数量控制在1～5×10⁷个/mL，将细胞转入流式细胞仪的流式管中，离心弃掉上清液，加入FACS分选缓冲液重悬，混匀后加入FCR Blocking试剂，室温孵育，加入40-60μL PBS缓冲液后加入4-6μL流式分选荧光抗体CD90和CD24，混匀，5℃避光孵育40-50min。

所述步骤1中肝癌细胞的培养方法为将肝癌细胞用含80-100u/mL的青霉素和链霉素的10％胎牛血清的DMEM高糖培育基在37℃、85-95％相对湿度、4-6％CO₂的培养箱中培养。

所述步骤2中肝癌细胞的消化传代方法为当细胞覆盖率达80-90％时将步骤1得到的肝癌细胞培养液吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋白酶消化至细胞脱落，终止消化，传代。

所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。

本发明的有益效果是：本发明采用荧光抗体CD90(一种分子量为25～37KDa的GPI锚定蛋白)和荧光抗体CD24(一种分子量为42KDa单链唾液酸糖蛋白)联合标记肝癌细胞，两种标记物在肝癌细胞中呈共表达，采用流式细胞仪检测肝癌细胞系中肿瘤干细胞标志物的表达，通过比较分选出CD90+CD24+肝癌细胞，检测CD90+CD24+肝癌细胞的干细胞生物特性，证明CD90和CD24均表达的肝癌细胞即为肝癌干细胞。本发明选取两种标志物进行联合检测，提高了肝癌干细胞的分离和鉴定的成功率。本发明方法操作简单，可以快速、高效地分离出肝癌干细胞，提供了一种新的分离肝癌干细胞的方法，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是肝癌干细胞CD90+CD24+标记在Huh-7肝细胞癌细胞的表达图。

图2是从RNA水平上检测CD90和CD24在CD90+CD24+Huh-7、CD90+CD24-Huh-7、CD90-CD24+Huh-7、CD90-CD24-Huh-7四种表型肝癌细胞亚群中表达的灰度分析图。

具体实施方式

本发明实施例中所用试剂来源如下：

胎牛血清：上海生物工程技术服务有限公司。

DMEM培育基：美国Hyclone公司。

胰蛋白酶、PE-CD90、FITC-CD24：美国Gibco公司。

FACS分选缓冲液：PBS(称取氯化钠8g，氯化钾0.2g,磷酸氢钠3.4785g,磷酸二氢钾0.2g，加水至1升)500mL+0.5M EDTA 2mL+牛血清白蛋白2.5g。

FCR Blocking试剂：上海浩然生物技术有限公司。

bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(寡肽-1)、LIF(白血病抑制因子)：美国Peprotech公司。

B27(细胞培养添加剂)、RNA提取试剂盒：美国Invitrogen公司。