[发明专利]用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）多功能氧化石墨烯材料的合成

a. 磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50 mL 1 mg/mL的氧化石墨烯，超声1 h；然后在氮气氛保护下加入20～30 mL 0.05～0.07 mol/L的氯化亚铁溶液和20～30 mL 0.10～0.15 mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15 mL 20%～30%的氨水至溶液的pH = 10～11，回流处理3～5 h；冷却后，用二次水洗涤至溶液的pH = 7，定容到50 mL，即得磁性氧化石墨烯材料溶液，4 ℃储存备用；

b. 取步骤（a）中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于玻璃瓶中，超声1 h，然后加入200～400 μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH = 4～6，振荡孵育1 h，二次水洗涤3次；再加入30～50 μL 0.001～0.1 mol/L的电化学发光体溶液和30～50 μL 10～20 μmol/L的适配体溶液，混合均匀，然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH = 8～10，振荡孵育4 h，二次水洗涤3次后；加入质量百分浓度为1～2%的牛血清白蛋白溶液100～200 μL，4℃下浸泡1 h，二次水洗涤3次，定容至200 μL，即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶液，4 ℃下储存备用；

（2）电化学发光适配体传感器的组装

将直径为3～5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝浆抛光打磨，然后在乙醇和二次水中分别超声2 min，氮气吹干；取5～10 μL步骤（1）中制备的多功能化氧化石墨烯材料溶液，滴涂到上述预处理过的磁性玻碳电极表面，多功能化氧化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附到电极表面，即得电化学发光适配体传感器。

2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。

3.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10～100 mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1～10 mmol/L。

4.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述的适配体为氨基修饰的DNA片段，碱基序列为：5′-NH₂-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′。

5.一种利用权利要求1-4中任一项所述的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法，其特征在于具体步骤如下：

将权利要求1-4中任一项制备的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液中，37℃下温育1 h，然后使用二次水轻轻洗涤后作为工作电极；使用铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极或饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系置于缓冲溶液中，启动电化学反应，测量体系的电化学发光强度值；获得一系列不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与肿瘤标志物MUC1浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测待测样品中肿瘤标志物MUC1的浓度。

6.根据权利要求5所述的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为含有1～3 mmol/L H₂O₂的0.05 mol/L pH = 9～11 的Na₂CO₃-NaHCO₃体系缓冲溶液。

7.根据权利要求5所述的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法，其特征在于电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法；脉冲宽度：0.25秒；脉冲间隔：30秒；初始电压：0 V；脉冲电压：1 V。