[发明专利]一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。有来自链霉菌的链霉素、小单孢菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有阿米卡星等半合成氨基糖苷类。虽然大多数抑制微生物蛋白质合成的抗生素为抑菌药，但氨基糖苷类抗生素却可起到杀菌作用，属静止期杀菌药。

氨基糖苷类抗生素对于细菌的作用主要是抑制细菌蛋白质的合成，作用点在细胞30S核糖体亚单位的16SrRNA解码区的A部位。研究表明：此类药物可影响细菌蛋白质合成的全过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放，从而导致细菌死亡。

氨基糖苷类抗生素在临床上主要用于敏感需氧革兰阴性杆菌及阳性球菌等致病性细菌所致的全身感染。由于氨基糖苷类抗生素对铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、大肠杆菌等常见革兰阴性杆菌的PAE较长，所以，该类药物被广泛被用于治疗需氧革兰阴性杆菌所致的严重感染，如脑膜炎、呼吸道、泌尿道、皮肤软组织、胃肠道、烧伤、创伤及骨关节感染等。另外，对于败血症、肺炎、脑膜炎等细菌引起的严重感染，常常使用氨基糖苷类及其他类别抗生素的联合用药方案，此外，在畜牧业和中水产业中，该类抗生素不但被广泛用于防治各种动物性疾病，而且常添加到饲料中，用于促进动物生长发育。在欧洲，每亩鱼池规定可以投放50公斤的抗生素，而在我国动物用的剂量根本没有明确规范，通常动物刚一出生即使没病也要先对其使用抗生素“预防”，避免因大规模发病而遭受巨大的损失。

近30年来，由于大量治疗用抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。抗生素耐药性是由使用抗生素药物，特别是对抗生素药物的不当使用造成的，当细菌发生突变或获得耐药基因时，就产生了耐药性。氨基糖苷类药物在临床中的广泛应用使得越来越多的产生了对该类抗生素耐药的菌株，导致临床治疗失败。另外，因为在畜牧养殖业中广泛使用氨基糖苷类抗生素的情况非常普遍，不仅动物、禽类及鱼类体内残留的抗生素会转移到人体，它们体内产生的耐药菌和耐药基因也会传播给人类。这样就需要一种能方便快捷的检测细菌耐药性的方法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。

耐药性的检测可以分为常规表型检测(即药敏试验)和耐药基因型检测。常规药敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的。在过去的2O年，为适应临床需要，以DNA探针和聚合酶链反应(PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方法已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂，所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂盒，实现对常见细菌氨基糖苷类耐药基因aac(3)-II、aac(6')-Ib、aph(3')-III、ant(3″)-1a、ant(4')-1a的快速检测，以弥补现有检测方法的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物，它包括如下引物对：

(1)扩增aac(3)-II耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)扩增aac(6')-Ib耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；