[发明专利]一种检测金黄色葡萄球菌的DNA传感器及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的DNA传感器及其制备与应用，属于致病菌快速检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水体、灰尘及人和动物的排泄物中都可以找到。金黄色葡萄球菌是一种重要的致病微生物，它能产生较多的毒素和酶等毒力因子，且毒力强，由金黄色葡萄球菌感染可引起多种疾病，包括食物中毒、假膜性肠炎、烫伤皮肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，给人类造成了极大的威胁和损失，引起了人们的广泛关注。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性的卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大达45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。

目前，金黄色葡萄球菌的检测方法大致包括传统的细菌培养方法及生化鉴定、免疫学方法、荧光定量PCR法、荧光原位杂交法(FISH，Fluorescent in Situ hybridization)以及基因芯片法等，这些检测方法均有各自的优势但同时也存在不同层次上的不足，比如FISH法能够直接运用到复杂样品的检测中，且无需提取样品的DNA，直接保留了样品DNA的完整性；但样品中某些菌体本身的自体荧光，荧光探针信号的衰减，固定的微生物细胞过少等因素均可能导致实验产生假阴性结果；基因芯片法是近年来迅速发展起来的核酸检测技术，其快速、方便简单等优势成为该技术的亮点，但由于该技术需要昂贵的先进检测设备和运行成本，使其难以推广应用。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜DNA传感器，利用碳纳米管具有增强电化学电子传递速率，降低阻抗的功能，金纳米粒子具有生物固定的作用，制备电化学DNA传感器，可有效提高检测的灵敏度。本发明通过合成金黄色葡萄球菌特异性基因序列作为探针ssDNA，与互补目标ssDNA片段形成杂交体系，以亚甲基蓝作为杂交指示剂的的检测技术，初步建立了对金黄色葡萄球菌检测的一种通用性好、高灵敏度和精确度的检验方法及其检测条件。

本发明的第一个目的是提供一种DNA生物传感器。

所述DNA生物传感器的制备方法：是将含壳聚糖的碳纳米管、纳米金依次修饰到清洁的金电极表面，然后将含巯基的探针ssDNA滴加到修饰后的电极上，孵育，再用6-巯基己醇封闭，即制得基于电化学碳纳米管/金纳米粒子自组装DNA传感器。

所述探针ssDNA，在本发明的一种实施方式中，其序列是SEQ ID NO.1所示的序列。该序列是金黄色葡萄球菌的特异性基因序列，使用该序列制备的DNA传感器对金黄色葡萄球菌的检测具有通用性好、高灵敏度和精确度的优点。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：(1)碳纳米管修饰金电极：将4～6μL的每mL含有0.5～2mg碳纳米管的碳纳米管溶液滴加到清洁的2mm金电极表面，孵育30～40min；(2)纳米金修饰金电极：将氯金酸溶于硝酸钾溶液中，配制成纳米金溶液，将上一步得到的碳纳米管修饰金电极浸入纳米金溶液中进行电镀沉积，即制备得到修饰好的电极；(3)探针ssDNA滴加：将4～6μL的探针ssDNA滴加到修饰好的电极表面，孵育30～40min；(4)封闭：滴加6～8μL浓度为0.5～2mM的6-巯基己醇，孵育40-60min，即得到自组装电化学DNA传感器。

所述清洁的金电极，是指经如下处理的金电极：将金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15min，依次用0.3μm，0.05μm的A1₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用l：l(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用。

所述电镀沉积，在本发明的一种实施方式中，是采用控制电位电解库伦法进行电镀沉积，具体条件：电解电位为-0.2V，电解时间为300s。

所述孵育，在本发明的一种实施方式中，是在35～40℃下进行。