[发明专利]一种抗癌药物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物筛选技术领域，具体涉及一种采用原位邻位连接技术筛选能够破坏Hsp90和Cdc37相互作用的抗癌药物的方法。

背景技术

邻位连接技术（proximity ligation assay, PLA）是一项高度特异和灵敏的蛋白质分析技术。能够检测蛋白质表达水平、蛋白质之间的相互作用和蛋白质的转录后修饰（如磷酸化修饰），已经被应用于一系列的生物研究系统中。该方法通过两个分别特异性针对目标蛋白的抗体识别复合物中的两个相互作用的蛋白。这种方法通过在种属性抗体上修饰单链DNA寡核苷酸，形成邻位探针，识别针对目的蛋白的特异性抗体。如果这两个特异性抗体结合的抗原相互作用，可以使两对相对应的种属性抗体连接的DNA也在空间上靠近，可以和随后加入的两条连接DNA共同形成一个DNA环，作为滚环复制（RCA）的模板，并通过滚环复制形成大量的连续单链DNA。这时，加入一个修饰有荧光标记的DNA短序列，它能够杂交到环上，大量的单荧光信号堆积，在显微镜下可以观察到一个个点，这就是能够直接观测到相互作用的两个蛋白质分子在细胞中的定位。而传统的免疫荧光只能够对两个蛋白质共定位。原位PLA技术检测操作简单，并且可以建立剂量响应曲线，根据曲线计算蛋白间亲和能力（半数最高抑制浓度，IC50）。PLA技术作为一项新的蛋白质分析工具，可以检测蛋白水平、蛋白间的相互作用、蛋白的翻译后修饰水平的变化，具有很高的特异性和灵敏度，可以用于炎症、肿瘤疾病等病理生理过程研究，甚至可用于细胞表面蛋白功能状态的观察，以及病毒和细菌等感染因子的检测，在基础研究和疾病诊断等研究领域中具有重大意义。

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）也称作应激蛋白，是一系列高度保守且功能强大的分子伴侣，其中Hsp90占细胞总蛋白量的1%-2%，主要包括3个结构域，（1）N端结构域，约25kDa，包括与蛋白ATP酶活性相关的腺嘌呤结合区；（2）中间结构域，约35kDa，能够与其他分子伴侣以及其他蛋白发生结合的区域；（3）C端结构域，约10kDa，含有MEEVE序列，能够和一些含TPR结构域的共分子伴侣结合，也可形成自身的二聚化。蛋白质HSP90在大量的细胞过程、进化和疾病中都扮演着重要的角色。正常情况下，它能够防止蛋白错误折叠发生聚集，能够调节细胞在压力/非压力状态下的生命活力，能够与凋亡效应因子相互作用抗凋亡。Hsp90的底物蛋白多是细胞内信号转导通路的关键蛋白成分，与肿瘤的发生、发展密切相关，这些蛋白质的过表达或过度激活是肿瘤发生发展中重要的标志。Hsp90本身在许多癌细胞中也会过量表达，使肿瘤细胞相比于正常细胞，更能适应恶劣环境。

在众多的Hsp90的辅助伴侣分子中，细胞分裂周期蛋白（cell division cycle protein，Cdc）Cdc37可以特异性地辅助Hsp90和多种蛋白激酶的结合，Hsp90和Cdc37的相互作用是Hsp90和底物蛋白相互结合所必须的。人的Cdc37蛋白可以分成C端结构域，中间结构域和N端结构域，其中C端结构域对于Cdc37与Hsp90的相互作用至关重要，而N端结构域主要负责和激酶等底物蛋白的催化结构域结合。而在癌症细胞中，Hsp90和Cdc37的表达量明显上调。如Cdc37在正常前列腺上皮细胞中不表达，而在前列腺肿瘤中高度表达。许多的HSP90客户都是致癌蛋白激酶，Hsp90/Cdc37复合物在致癌蛋白激酶的成熟和活性调节中起到关键的作用，当过度激活时这些蛋白可以导致癌症。目前研究发现，Cdc37可以将一些底物蛋白运输至Hsp90复合物，在Hsp90的作用下这些蛋白正确折叠，以及正常功能的行使。当敲掉Cdc37时，Hsp90的一些与细胞增殖、细胞周期调节、细胞凋亡以及重要信号通路相关的底物蛋白的表达水平会有明显的下降，这使得这一复合物成为非常重要的癌症治疗的潜在靶点。当前在临床试验中已有20种小分子Hsp90抑制剂用于抗肿瘤研究。本发明中提出的原位邻位连接技术在细胞水平进行高通量药物筛选，寻找能够破坏Hsp90和Cdc37相互作用的小分子化合物。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：提供一种采用邻位连接技术在细胞水平筛选破坏Hsp90和Cdc37相互作用药物的方法，这种药物可以应用到抗癌治疗。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

提供一种抗癌药物的筛选方法，该方法的具体步骤如下：