[发明专利]不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子

说明书

不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，包括：若干物种检测区及若干连接序列区，所述物种检测区与连接序列区相间排列交替出现；所述物种检测区的个数至少为两个，且为不同种属物种检测区；所述连接序列区为与待检测物种序列不同的随机序列。所述物种检测区包括引物序列区与特异识别区，所述特异识别区的序列长度模拟相应待检测物种的特征检测序列长度，所述特异识别区的序列与待检测物种中的基因组DNA序列无同源性，存在明显特异区别。本发明提供的人工外源性参照分子，可以同时含有两种或两种以上不同微生物的通用引物序列区域，并且含有可以人为识别的特异序列，用于不同种属微生物间种类和丰度比较。

技术领域

本发明涉及微生物检测和分析技术领域，尤其涉及一类用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子。

背景技术

微生物涉及到病毒、细菌、真菌等，种类繁多并且无处不在，环境中、人体表面、人体各内部腔体表面甚至器官内都存在大量的微生物。相对于人类健康来说，微生物可以分为有害微生物、有益微生物。多数微生物的感染在一定条件下会导致疾病，但也有一些有益的微生物是人体维持健康平衡必不可少的因素。随着生命科学研究进步，研究者发现人体特定部位混杂伴随群居的微生物之间有相对稳定的种类，并且呈一定的相对比例。微生物间种类和相对丰度的改变可以影响人体健康，在某些情况下甚至是主要致病因素；同时，微生物间的相互影响，也并非只有同属种的微生物相互影响，越来越多的研究结果表明，不同属种的微生物间（比如细菌与病毒之间、细菌与真菌之间、病毒与真菌之间等）也存在相互影响，某些条件下，正是导致疾病发生的原因。因此，近些年科学家越来越重视将微生物群体作为一个相互影响的机体进行系统研究，被称为微生物组学研究（Microbiom）。

在大规模测序技术产生之前，微生物之间的鉴定分类主要依赖传统的形态、表型、生理生化分类，这些技术难以批量规模化检测，并且费时、费力，分型、量化不准确。随着分子生物学的迅速发展，目前大规模测序很好的解决了这方面问题。大规模测序的原理主要是基于微生物的基因序列特点实现的。

同种属的微生物间的基因序列既有在进化过程中基本不变化或变异程度很小的保守序列区域，又有种类之间差异表达的可变序列区域。在有核生物中，核糖体RNA（rRNA）及对应的编码基因核糖体DNA（rDNA）成为很好的区域，同时包含两种序列区域，并且长度大小合适，适合现有技术框架下的序列分析。目前使用较多的有5SrRNA/rDNA、5.8SrRNA/rDNA、16SrRNA/rDNA、18SrRNA/rDNA、23SrRNA/rDNA、ITS（Internal transcribed space，内转录间隔区）等区的序列。具体原理为根据这些保守区设计出通用引物，从而扩增出采集的样本中的所有同一个种属的微生物片段，对这些片段进行测序，就可以检测到两个保守的通用引物之间的可变区的基因序列，分析这些可变区的序列差异就可以实现对微生物的分类。检测不同种类微生物的测序条数（reads）就可以知道微生物间的相对丰度。

不同种属的微生物间的基因序列差异比较大，适合用以测序检测的保守区域及其序列也往往不同。而不同的基因序列以及扩增片段的长度是制约扩增反应条件。因此，目前比较普遍的做法是针对有相同通用引物的同一种属的微生物，设计扩增试剂盒，进行扩增及测序检测。通用引物不同的微生物，各自单独扩增和测序，但不同批次的扩增反应和测序存在批次间扩增效率以及其他影响因素的差异，这就造成微生物种类和丰度的检测只能在同种属之间进行，而同时定居在同一空间区域的不同属的微生物间则不能进行比较。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一类人工外源性参照分子，该序列可以同时含有两种或两种以上不同微生物的通用引物序列区域，并且含有可以人为识别的特异序列，用于不同种属微生物间种类和丰度比较。