[发明专利]高正电荷荧光蛋白在糖胺聚糖分析检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及高正电荷绿色荧光蛋白在糖胺聚糖研究中的应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)又称为粘多糖，是重复二糖单位组成的直链聚阴离子多糖。主要包括透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS)，硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角质素(Keratan Sulfate，KS)。除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺组成以外，其它GAGs的二糖单位均是由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸)与己糖胺(N-乙酰葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺)组成。其中HA结构相对简单，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的二糖单位经β-1,4-糖苷键连接而成。其它GAGs则由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂，主要表现在糖链中不同部位羟基(-OH)和氨基(-NH₂)的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。GAGs糖链结构的这种高度复杂性不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。

GAGs广泛存在于动物细胞细胞表面和细胞基质中，通过与各种蛋白的特异相互作用参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程[1-4]，GAGs所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如Hep、CS、HA等[5,6]。

GAGs的结构相对于核酸和蛋白质来说更为复杂，它的结构复杂性和多样性为研究其结构与功能的关系带来了很大的挑战。各种阳离子染料(如：阿利新蓝,甲苯胺蓝和酰胺黑等)常被用于样品中GAGs的染色和检测。然而这类染料具有很多缺点，如生物相容性较差，不适用于对活细胞和组织染色；选择性较低，致使出现很高的背景值；灵敏度较低等。近年来，各种新型的阳离子发色团被合成并用于缓冲液或血清中的Hep进行高灵敏度检测，但其生物相容性及在其它糖胺聚糖检测方面的应用有待进一步研究。因此，亟待发展一种生物相容性好、灵敏度高的多用途GAG探针用于各种生物样品中GAGs的观察和检测。

绿色荧光蛋白(GFP)是最早在一种学名为Aequorea victoria的水母中发现的。因为GFP与活体生物的生物相报道基因被用于细胞生物学和分子生物学研究。并且GFP可以作为分子探针用于活体的实时监测。最近，通过将GFP上的一些非保守氨基酸突变为赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，从而在不影响GFP荧光特性的情况下使其带大量的正电荷，这种高正 电荷绿色荧光蛋白已被成功用于蛋白与核酸进入细胞的运输载体，并作为核酸检测的高灵敏度探针[7,8]。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种新的检测糖胺聚糖的手段，即运用高正电绿色荧光蛋白对糖胺聚糖进行定性定量分析检测。

本发明的技术方案如下：

高正电荷荧光蛋白作为荧光标记物在糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物分析检测中的应用，所述高正电荷荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述的糖胺聚糖类似物选自天然或人工半合成及全合成的聚阴离子多糖；进一步优选，所述的糖胺聚糖类似物选自：硫酸化多糖、多聚唾液酸、褐藻胶、卡拉胶，岩藻聚糖或脂多糖。

根据本发明优选的，具体步骤如下：

(1)使样品与高正电荷荧光蛋白接触，进行孵育结合，孵育时间5～30min，孵育后待测样品；

(2)去除未与待检测样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物结合的高正电荷荧光蛋白，或者采用荧光淬灭剂淬灭与待检测样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物结合的高正电荷荧光蛋白，制得待检测样品；

(3)对待检测样品进行荧光测定，根据荧光强度对样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物含量进行定性和/或定量分析。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的样品为液体、固相载体、细胞、组织、器官。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，高正电荷荧光蛋白的接触浓度为0.01-5.0μg/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，荧光淬灭剂选自：石墨烯、纳米金和/或有机小分子荧光淬灭剂。