[发明专利]检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒

权利要求书

1.检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒，其特征在于：包括：1)酶标板，2)单抗，3)酶标试剂，4)底物显色液，5)终止液，6)标准抗原，7)阴性标准对照，8)10×洗涤液，所述的酶标板为包被有兔源大肠杆菌O157:H7抗血清的96孔板，包被浓度为3.2ug/mL，所述大肠杆菌O157:H7抗血清指菌体浓度为10⁹CFU/mL的大肠杆菌O157:H7，甲醛灭活后，四次免疫家兔后制备所得。

2.根据权利要求1所述的检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒，其特征在于：

所述的酶标板包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，且酶标板为2块；

所述的单抗为PBS缓冲液1:400稀释的大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体EO06；

所述的酶标试剂为PBS缓冲液1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG；

所述的底物显色液为单组份3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液；

所述的终止液为2M的硫酸溶液；

所述的标准阳性抗原为大肠杆菌O157:H7甲醛灭活48h所制备的全菌抗原；

所述的阴性标准对照为大肠杆菌O157:H7培养用EC肉汤培养基；

所述的10×洗涤液为含有质量浓度分别为5％Tween-20、8.5％氯化钠、0.2％氯化钾、2.9％磷酸氢二钠和0.2％磷酸氢二钾的水溶液。

3.根据权利要求1所述的检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒操作步骤如下：

1)准备：从冰箱取出试剂盒，室温放置30min。用蒸馏水将10×洗涤液稀释成1×洗涤液；

2)加样：取出酶标板，固定于框架上，分别设置阴阳性对照孔、待检样品孔和空白对照，记录各孔位置。待检样品、阳性对照和阴性对照加入待样品孔、标准品孔，100uL/孔。空白对照孔不加；

3)温育：37℃湿盒内孵育1h；

4)洗板：弃去液体，吸水纸拍干，每孔加洗涤液250uL，静置3min，甩去洗涤液，如此重复洗板3次；

5)加酶标试剂：每孔加入酶标试剂100uL；

6)洗板：同步骤(4)；

7)显色：每孔加入底物显色液100uL，轻轻震摇30s，室温避光反应15min；

8)终止：每孔加入50uL终止液终止反应；

9)测值：在自动酶联检测仪测定各孔的光密度吸收值(OD450nm)；

10)结果判定。

4.根据权利要求3所述的检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒，其特征在于：判定标准为：光密度吸收值≥0.231，且S/N≥2.1为阳性；光密度吸收值<0.231，且S/N<2.1为阴性。