[发明专利]检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒在审

专利信息
申请号: 201510048127.5 申请日: 2015-01-29
公开(公告)号: CN104730246A 公开(公告)日: 2015-06-24
发明(设计)人: 张雪寒;何孔旺;李盟;汪伟;俞正玉;倪艳秀;温立斌;李彬;周俊明;王小敏 申请(专利权)人: 江苏省农业科学院
主分类号: G01N33/577 分类号: G01N33/577
代理公司: 四川君士达律师事务所 51216 代理人: 芶忠义
地址: 210009 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 检测 大肠杆菌 o157 h7 elisa 试剂盒
【权利要求书】:

1.检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒,其特征在于:包括:1)酶标板,2)单抗,3)酶标试剂,4)底物显色液,5)终止液,6)标准抗原,7)阴性标准对照,8)10×洗涤液,所述的酶标板为包被有兔源大肠杆菌O157:H7抗血清的96孔板,包被浓度为3.2ug/mL,所述大肠杆菌O157:H7抗血清指菌体浓度为109CFU/mL的大肠杆菌O157:H7,甲醛灭活后,四次免疫家兔后制备所得。

2.根据权利要求1所述的检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒,其特征在于:

所述的酶标板包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,且酶标板为2块;

所述的单抗为PBS缓冲液1:400稀释的大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体EO06;

所述的酶标试剂为PBS缓冲液1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG;

所述的底物显色液为单组份3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液;

所述的终止液为2M的硫酸溶液;

所述的标准阳性抗原为大肠杆菌O157:H7甲醛灭活48h所制备的全菌抗原;

所述的阴性标准对照为大肠杆菌O157:H7培养用EC肉汤培养基;

所述的10×洗涤液为含有质量浓度分别为5%Tween-20、8.5%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸氢二钾的水溶液。

3.根据权利要求1所述的检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒操作步骤如下:

1)准备:从冰箱取出试剂盒,室温放置30min。用蒸馏水将10×洗涤液稀释成1×洗涤液;

2)加样:取出酶标板,固定于框架上,分别设置阴阳性对照孔、待检样品孔和空白对照,记录各孔位置。待检样品、阳性对照和阴性对照加入待样品孔、标准品孔,100uL/孔。空白对照孔不加;

3)温育:37℃湿盒内孵育1h;

4)洗板:弃去液体,吸水纸拍干,每孔加洗涤液250uL,静置3min,甩去洗涤液,如此重复洗板3次;

5)加酶标试剂:每孔加入酶标试剂100uL;

6)洗板:同步骤(4);

7)显色:每孔加入底物显色液100uL,轻轻震摇30s,室温避光反应15min;

8)终止:每孔加入50uL终止液终止反应;

9)测值:在自动酶联检测仪测定各孔的光密度吸收值(OD450nm);

10)结果判定。

4.根据权利要求3所述的检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒,其特征在于:判定标准为:光密度吸收值≥0.231,且S/N≥2.1为阳性;光密度吸收值<0.231,且S/N<2.1为阴性。

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