[发明专利]检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒。

背景技术

大肠杆菌O157:H7是一种重要的人兽共患病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。大肠杆菌O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)，还可在5％-10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。大肠杆菌O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。

酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种以免疫学反应为基础，将免疫反应与酶对底物的高效催化作用相结合的生化技术，它具有特异、灵敏、快速等特点。目前对抗原的检测多采用夹心法ELISA，即将抗体包被至固相载体捕捉待检抗原形成抗原-抗体复合物，然后加入能够催化底物变色的酶标二抗，可根据颜色反应的深浅对待检抗原进行定性或定量分析。ELISA的敏感性和特异性主要取决于抗体的亲和力和特异性。Choong等建立的大肠杆菌O157多克隆抗体双夹心ELISA法可直接检测血性粪便标本，其特异性和敏感性分别为99.5％和91.2％。Reymond等用大肠杆菌O157脂多糖(LPS)作为抗原包被，检测病人血清，其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为95％、94％、80％、98％。刘红亮等以LPS为抗原，通过杂交瘤技术制备出大肠杆菌O157:H7LPS的单克隆抗体，并建立大肠杆菌O157:H7双抗体夹心ELISA检测方法，与受试的菌株无交叉反应，对大肠杆菌O157:H7纯培养菌液的检出下限是3×10⁴CFU/mL。葛萃萃等建立的大肠杆菌O157双抗夹心ELISA检测方法对纯培养菌液检出限为10⁵CFU/mL，具有良好的敏感性及特异性，并且染菌食品经过选择性培养后，该方法可检出培养12h后接种量为0.1～1CFU/g(mL)的样品。

现有技术存在以下缺陷：全菌抗原作为免疫原，成分复杂，难以筛选到高滴度且特异性高的单克隆抗体，并且操作过程中，存在生物安全的风险；提取的LPS为多糖类物质，将其作为免疫原，抗原性一般较差，且很难达到特异性检测致病血清型大肠杆菌O157:H7的目的。正是由于上述免疫原选择的欠缺，可能导致夹心ELISA方法敏感性和特异性较低。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，旨在提供一种检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒。

本发明具体通过以下技术方案实现：

检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒，包括：1)酶标板，2)单抗，3)酶标试剂，4)底物显色液，5)终止液，6)阳性标准抗原，7)阴性标准对照，8)10×洗涤液，所述的酶标板为包被有兔源大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的96孔板，包被浓度为3.2ug/mL。所述的多克隆抗体指菌体浓度为10⁹CFU/mL的大肠杆菌O157:H7，甲醛灭活后，四次免疫家兔后制备所得。

所述的酶标板包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，且酶标板为2块。

所述的单抗指PBS缓冲液1:400稀释的紧密素单克隆抗体EO06，所述的EO06单克隆抗体为高效的杂交瘤细胞4C4分泌的，效价高达1:102000，对应紧密素抗原表位QTSSEQRSGVSS。

所述的酶标试剂为PBS缓冲液1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，所述的HRP-羊抗鼠IgG购自Boster公司。

所述的底物显色液为单组份3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液。

所述的终止液为2M的硫酸溶液。

所述的标准抗原指大肠杆菌O157:H7甲醛灭活48h所制备的全菌抗原，所述的阴性标准对照为大肠杆菌O157:H7培养用EC肉汤培养基。

所述的10×洗涤液为含有质量浓度分别为5％Tween-20、8.5％氯化钠、0.2％氯化钾、2.9％磷酸氢二钠和0.2％磷酸氢二钾的水溶液。

本发明检测大肠杆菌O157:H7的双抗ELISA试剂盒的操作步骤如下：

1)准备：从冰箱取出试剂盒，室温放置30min。用蒸馏水将10×洗涤液稀释成1×洗涤液；