[发明专利]一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物病毒技术领域，具体涉及一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法。

背景技术

鸭黄病毒(鸭坦布苏病毒)是一种可以导致蛋鸭产蛋机能严重下降的病毒，其临床表现为产蛋率突然下降，产蛋高峰期缩短，严重的在短时间内产蛋率可降为零，采食量也会同时下降，个别有死亡现象。病理剖解可见卵巢充血、肿胀、坏死和萎缩等严重病变。该病自从2010年首次在国内被发现后，已经造成山东、湖南、广东等蛋鸭养殖大省蛋鸭大面积减产。目前，许多研究机构在临床分离到了鸭黄病毒，并在体外进行了细胞感染试验，试图通过体外培养来使该病毒增殖以期用于鸭黄病毒疫苗的研制。多篇文献报道指出，临床分离到的鸭黄病毒可对多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、BHK细胞等，但原代病毒培养过程较为缓慢，病毒滴度不够高，对于疫苗的研发是一个需要解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，本发明所述的培养方法主要通过改变鸭黄病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而大大提高鸭黄病毒病毒滴度。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，其包括以下步骤：

A、DMEM培养液的配制：将13.4g DMEM干粉溶于1000ml去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至6.8～7.8，并用≤0.22um的无菌滤膜进行除菌过滤，置于≤4℃的冰箱待用；

B、往上述的DMEM溶液中加入占DMEM培养液体积1％～8％的胎牛血清后，接种细胞进行单层培养；

C、待单层细胞培养好后，弃去培养容器内的DMEM培养液，并用无菌洗液洗2～3次；

D、弃去无菌洗液，然后往培养容器内加入亲和剂和步骤A所述的DMEM培养液，其中亲和剂的体积用量为DMEM培养液体积用量的0.01％～1％；

E、将培养容器置于细胞培养箱中静置培养1min～30min后，接种鸭黄病毒，混合均匀后置于细胞培养箱中培养2～5天，收获病毒液。

具体地，步骤B中所述的细胞为Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种。

具体地，步骤C中所述的无菌洗液为去离子水、PBS缓冲液、无血清DMEM培养液中的一种。

具体地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：

丙二酸0～1％；磷酸0～1％；

山梨酸0～0.5％；苹果酸0.01～1％；

无机盐0～3.5％；去离子水余量。

优选地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：

丙二酸0.03～0.08％；磷酸0.06～0.08％；

山梨酸0.1～0.3％；苹果酸0.03～0.08％；

无机盐0.05～3％； 去离子水余量。

优选地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：

丙二酸0.05％；磷酸0.08％；

山梨酸0.3％； 苹果酸0.05％；

无机盐0.2％； 去离子水99.32％。

具体地，所述无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠中的一种或两种以上。

具体地，所述的硫酸钠占亲和剂总量的0.15～0.3％；所述的磷酸二氢钠占亲和剂总量的0.1-1.6％；所述的氯化钠占亲和剂总量的0.09-0.9％；所述的氯化钾占亲和剂总量的0.01-1％。

具体地，所述的亲和剂是按以下步骤制备而成的：按配方量称取丙二酸、磷酸、山梨酸、苹果酸、无机盐，将上述组分溶于配方量的去离子水中，过滤即得。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明所述的培养方法主要是在培养过程中通过添加亲和剂，改变鸭黄病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞间亲和度，使鸭黄病毒更加快速地感染生产用细胞，提高了鸭黄病毒对细胞的感染效率，从而可以在体外培养实验中更加快速地获得高病毒滴度的鸭黄病毒，为鸭黄病毒的疫苗研发奠定基础。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，其包括以下步骤：

A、DMEM培养液的配制：将DMEM干粉溶于去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至6.8～7.8，并用0.22um的无菌滤膜进行除菌过滤，置于4℃的冰箱待用；