[发明专利]一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、以染毒材料的cDNA为模板，以ASPV-cp-F₂和ASPV-cp-R₂为引物进行PCR扩增，所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用载体连接后转化到感受态细胞，挑取阳性克隆增菌培养后进行质粒提取和鉴定，得到阳性重组质粒标准品；

2)、以经过梯度稀释的所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R为引物、以ASPV-Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；

3)、以供试材料的cDNA为模板，按照与步骤2)相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测；

其中，所述ASPV-cp-F₂、ASPV-cp-R₂、ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R和ASPV-Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

2.权利要求1所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤1)中：所述染毒材料的cDNA的制备方法包括：

提取感染有苹果茎痘病毒材料的总RNA，并以该RNA为模板进行反转录，得到染毒材料的cDNA。

3.根据权利要求1所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤1)中，所述琼脂糖凝胶电泳中所用的琼脂糖凝胶的浓度为1-2％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤1)中：

所述载体为pEASY-T₃，所述感受态细胞为E.coli DH5α。

5.根据权利要求4所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤2)中：

所述阳性重组质粒标准品的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间。

6.根据权利要求5所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤2)中：

所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度范围为：1.0×10⁸拷贝/μL～1.0×10¹拷贝/μL，且所述梯度稀释的倍数为10倍。

7.根据权利要求6所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤2)中：

所述标准曲线以所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，以所述Ct值为纵坐标。

8.根据权利要求7所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述实时荧光定量PCR的过程中，反应体系为：

TransStart Probe qPCR Super Mix 10μL，ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R 4-5pmol，ASPV-Probe34-5pmol，模板1.0μL，双蒸水补齐至20μL。

9.根据权利要求8所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述实时荧光定量PCR的过程中，扩增程序为：

94℃预变性30-35s；94℃变性4-7s，55℃退火12-15s，72℃延伸15-20s，共35-40个循环。

10.根据权利要求8所述的苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR采用Bio-Rad iQ^TM5实时荧光定量PCR仪进行。