[发明专利]一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

苹果茎痘病毒是苹果和梨树上普遍发生的潜隐性病毒之一，该病毒能引起苹果茎痘病、梨脉黄病、梨石痘病等多种病害，可致苹果和梨产量下降，品质变劣，严重影响我国的果树生产。目前检测ASPV的方法主要是常规RT-PCR技术。

ASPV的常规RT-PCR检测技术方案包括以下步骤：

1、设计常规RT-PCR检测引物；

2、提取果树供试样品的RNA并反转录成cDNA；

3、以cDNA为模版，利用特异扩增引物进行常规PCR扩增；

4、将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳；

5、通过凝胶成像系统对电泳结果进行观察拍照，若观察到特异扩增条带可证明供试样品中含有ASPV，反则没有。

然而，ASPV的常规RT-PCR检测技术存在缺点：

(1)、操作步骤较为繁琐，费时费力；

(2)、需要对PCR扩增产物进行后处理，只有将扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳才能得到检测结果，但琼脂糖凝胶制作过程中需要加入致癌物质EB，易污染实验室环境，还会对实验人员的健康构成威胁，同时后处理过程中不同样品间易发生交叉污染，造成检测结果的假阳性现象；

(3)、常规RT-PCR技术只能对病毒进行定性检测，无法定量检测

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法具有可实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测、不存在假阳性以及环境污染、检测时间短以及灵敏度高的技术效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1)、以染毒材料的cDNA为模板，以ASPV-cp-F2和ASPV-cp-R2为引物进行PCR扩增，所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用载体连接后转化到感受态细胞，挑取阳性克隆增菌培养后进行质粒提取和鉴定，得到阳性重组质粒标准品；

2)、以经过梯度稀释的所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R为引物、以ASPV-Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；

3)、以供试材料的cDNA为模板，按照与步骤2)相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测；

其中，所述ASPV-cp-F₂、ASPV-cp-R₂、ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R和ASPV-Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

本发明提供的这种检测方法，其采用染毒材料的cDNA为模板，通过特定的引物扩增出产物，该产物再通过载体连接以及转化之后，获得大量复制的片段，挑取阳性克隆增菌培养并进行质粒提取和鉴定(酶切鉴定)进而获得阳性重组质粒标准品。根据该阳性重组质粒标准品分子量将其换算成拷贝数浓度，并梯度稀释；然后以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R为引物、以ASPV-Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线(Ct值-拷贝数浓度)。上述反应中，ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R和ASPV-Probe3为特定设置的特异性扩增引物和探针，且在ASPV-Probe3的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

以供试材料的cDNA为模板按照与构建上述标准曲线相同的条件进行cDNA为模板，通过供试材料反应的Ct值以及标准曲线，直接获得供试材料中的苹果茎痘病毒的含量。

该方法实现了供试材料中的苹果茎痘病毒的定量测定，而且检测结果可直接通过电脑软件读出，不需要凝胶电泳以及成像检测等操作，进而避免了检测结果假阳性的同时也避免了环境污染以及EB对操作人员造成的身体危害。另外，该检测方法整个检测过程仅需1小时左右，具有节约时间以及灵敏度高的优点。

可选的，在步骤1)中：所述染毒材料的cDNA的制备方法包括：