[发明专利]一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法

权利要求书

1.一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；

步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；

步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。

2.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，步骤一所述氧化剂包括高碘酸钠，所述高碘酸钠在反应溶液中的浓度为4–8mmoL。

3.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，步骤二所述蛋白为甲胎蛋白抗体、人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体、游离雌三醇抗体、抑制素A抗体和链酶亲和素。

4.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、取5mg大豆过氧化物酶溶于500μL PBS中，加入12mg/mL NaIO₄溶液500μL，混匀，置室温避光反应15min；后加入500μL，0.1–5v/v％乙二醇室温反应30min；

步骤二、将步骤一得到的溶液均分为五份，依次加入813μL、1mg/mL甲胎蛋白抗体，188μL、1mg/mL抑制素A抗体，200μL、1mg/mL人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体，100μL、1mg/mL游离雌三醇抗体和100uL、5mg/mL链酶亲和素混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mL NaBH₄溶液100μL，混匀，置4℃还原反应2h；

步骤三、步骤二得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加入PBS 500μL复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。

5.权利要求1-4任一权利要求所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，制备的生物探针所用的发光底物液为1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H₂O₂以及50mM pH 8.5的Tris-HCL缓冲液组成的混合溶液。