[发明专利]一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法。

背景技术

大豆过氧化物酶(Soybean peroxidase,SBP)是以血红素为辅基的III类过氧化物酶(EC 1.11.1.7)，SBP是一种由单一肽链与铁卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子与血红素结合构成全酶，含有大约分子量的18％的糖基，其等电点为3.9，在pH 3-8之间活性较高，作用范围可达pH 2-11。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)是一个阳离子酶，SBP和HRP同属于植物过氧化物酶超家族的III类酶，两者的结构和作用机理有许多相似之处。有研究表明，SBP的构象稳定性远高于HRP，HRP的解链温度为74℃(pH 7.0)，远低于SBP的86℃(pH 7.0)，SBP的结合能为43.3KJ/mol,而HRP只有17KJ/mol，主要原因是SBP与HRP的血红素键联不同，特别是与血红素相连的氨基酸活性位点不同。此外，SBP有更能暴露于溶剂的血红素边缘(血红素边缘是和底物相互作用的部位)使得SBP比HRP具有更高的催化活性。当使用SBP代替常用的HRP制备生物探针催化鲁米诺-过氧化氢反应用于化学发光检测时，由于HRP是阳离子酶，会与氧化底物自由基产物相互作用而使酶失活，而SBP是阴离子酶，不会因为氧化反应产物作用失活，会产生一个较长时间的化学发光信号。使用SBP代替常用的HRP作为标记酶，在耐热性能、底物作用范围、酸碱稳定性以及制备成本等多项指标上均有明显优势。

大豆过氧化物酶是从大豆加工副产物大豆皮中提取的一类具有很高活性的酸性同功酶，而大豆皮是制油厂大豆加工的副产物，原料价廉易得，能够用于大批量生产。同时大豆过氧化物酶具有的底物作用范围广、耐热性能高、酸碱稳定性好、pH适用范围宽等优点是同类过氧化物酶不可比拟的，所以采用大豆过氧化物酶代替辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶等过氧化物酶作为标记酶用于生物探针制备具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，采用大豆过氧化物酶为标记酶，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号持续时间短，发光信号不稳定的问题。

本发明采用以下技术方案：

一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，包括如下步骤：

步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；

步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；

步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。

步骤一所述氧化剂包括高碘酸钠，所述高碘酸钠在反应溶液中的浓度为4–8mmoL。

步骤二所述蛋白为甲胎蛋白抗体、人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体、游离雌三醇抗体、抑制素A抗体和链酶亲和素。

本发明采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，具体包括如下步骤：

步骤一、取5mg大豆过氧化物酶溶于500μL PBS中，加入12mg/mL NaIO₄溶液500μL，混匀，置室温避光反应15min；后加入500μL,0.1–5v/v％乙二醇室温反应30min；利用NaIO₄对大豆过氧化物酶进行氧化，氧化速度极为迅速，加入乙二醇及时阻止了氧化环境对酶活的继续损伤，在一定程度上保持了酶活；

步骤二、将步骤一得到的溶液均分为五份，依次加入813μL、1mg/mL甲胎蛋白抗体(AFP抗体)，188μL、1mg/mL抑制素A抗体(InhibinA抗体)，200μL、1mg/mL人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体(β-HCG抗体)，100μL、1mg/mL游离雌三醇抗体(uE3抗体)和100uL、5mg/mL链酶亲和素混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mL NaBH₄溶液100μL，混匀，置4℃还原反应2h；利用NaBH₄使碳氮双键变成单键，从而形成稳定的酶-蛋白分子；