[发明专利]制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法

权利要求书

1.制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：构建表达双特异性抗体的两个质粒，所述两个质粒都含双启动子，其中一个质粒表达的蛋白为特异结合肿瘤抗原的一条或两条多肽；另一个质粒表达的蛋白为特异结合免疫活性细胞抗原的一条或两条多肽；所述两个含双启动子的质粒还分别表达一种不同的荧光蛋白；若质粒表达的蛋白是两条多肽形式，则荧光蛋白利用内部核糖体进入位序列连接在一条多肽的C端，若是一条多肽形式，则荧光蛋白直接插入到载体的另一个启动子下游多克隆位点；

步骤2：将步骤1中得到的两种重组质粒进行转化、培养和提取；

步骤3：将步骤2中提取的两种重组质粒共转染至宿主细胞中；

步骤4：筛选表达双荧光的阳性单克隆细胞株。

2.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：若所述质粒表达的蛋白为一条多肽，则质粒上一个启动子用于起始转录蛋白单元，另一个启动子用于起始转录荧光蛋白；若质粒表达的蛋白为两条多肽，则质粒上的一条多肽的DNA编码序列的3’通过IRES连接荧光蛋白的DNA编码序列。

3.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述步骤2中两种重组质粒分别转化大肠杆菌。

4.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：在所述步骤2中还包括无菌纯化提取的质粒。

5.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：在所述步骤3中还包括添加筛选压力；优选地所述筛选压力为嘌呤霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。

6.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：在所述步骤4中用流式细胞仪或者荧光显微镜进行筛选。

7.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：还包括将筛选后的阳性单克隆细胞株进行扩大培养，用流式细胞仪或荧光显微镜检测其荧光强度。

8.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：还包括对筛选后的阳性单克隆细胞株利用流式细胞术进行快速稳定性评估，在10代以内确定单克隆细胞株的稳定性。

9.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述宿主细胞是哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

10.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述荧光蛋白能够正确指示转染后蛋白表达情况，是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。

11.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述双特异性抗体细胞株的表达产物中双抗体相对含量通过计算两种荧光的平均荧光强度比值进行评估。

12.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述双抗体细胞株表达水平的稳定性通过流式细胞学分析细胞荧光强度分布进行评估。

13.根据权利要求1-12任一所述方法制备和筛选的表达双特异性抗体细胞株。