[发明专利]制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体制备领域，特别是涉及一种制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，hetero conjugate antibody)是一类具有双功能的抗体分子，两价抗体中的Fab段具有不同特异性，能与不同的配体结合。抗肿瘤和抗免疫活性细胞CDl6或CD3的双特异性抗体，不仅具有激活NK细胞或T细胞作用，而且可以通过抗肿瘤的Fab段特异性结合肿瘤细胞发挥作用，提高局部NK细胞或T细胞浓度，增强效应分子杀伤肿瘤能力。也可通过抗体与某些细胞因子融合制备免疫细胞因子(immunocytokine)，加强肿瘤细胞附近细胞因子浓度，激发机体免疫功能，有效地杀伤肿瘤，减少毒副作用。另外，也可以应用人源性抗肿瘤单抗或人源性Fc段和鼠源性Fab段的嵌和性抗体，克服鼠源性抗体免疫原性，增强抗体介导细胞毒作用，达到杀伤肿瘤作用。双特异性抗体中包含着两种不同识别特异性抗原的Fab段，通过特异结合肿瘤抗原同时结合不同效应细胞和分子，达到有效杀伤肿瘤的作用。

目前，中国仓鼠卵巢细胞(CHO(Cricetulus griseus,hamster,Chinese,ovary)广泛用于生产抗体，通常高产的细胞株一方面是通过甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)或者蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine,MSX)进行加压扩增来得到，另一方面也有很多报道通过基因工程来得到高产细胞株。许多公司通过构建高转染效率的质粒如引入慢病毒载体(lentiviral vectors(LVs))来增强外源基因的整合效率，从而提高抗体产量或者通过增加增强子及隔离子来增强启动子的活力进而寻找高产细胞株；也有些公司改良转染方式，如采用Ca₃(PO4)₂试剂、PEI试剂或电穿孔等转染手段来提高转染效率等等，通过以上方法提高了转染效率后，从中筛选出找出稳定高产细胞株，进入下游的放大生产，仍需要一个漫长的过程。从传统的实验流程上来看，该过程通常需要6到12个月才能得到稳定的细胞株系，且需要消耗大量的人力物力，最终也不一定能够获得理想的高产细胞株。因此在大规模生产生物制品中，除了构建良好的高表达的质粒载体，提高转染效率等途径外，还需要找到一种方便快捷的能够提前筛选出高产细胞株，以及后期监测细胞株稳定性的方法，这样不仅能够缩短试验周期，并且可以减少人力物力的投入，这也是制备双特异性抗体成功的关键。

目前，缺少一套完善的能够早期筛选、鉴定稳定表达双特异性抗体细胞株的方法；大多数公司通过外源的包被来检测并筛选高产克隆细胞株，但是不能够完全真实地反映克隆细胞株的表达状态。

发明内容

因此，为了解决目前筛选表达双特异性抗体细胞株稳定性方法耗时长，鉴定过程繁琐，且准确性不高等不足之处，本发明提供一种新的制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法。

本发明的关键在于所使用的质粒为双启动子质粒，且引入了荧光蛋白作为指示标签。荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的分子量为20-30kD的一类同源性蛋白，主要包括绿色荧光蛋白和它的一些突变体，如蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝绿荧光蛋白等等，还有从珊瑚中发现的红色荧光蛋白。它们具有自动发光、易检测等特点，在生物中它们常常作为报告基因。

内部核糖体进入位序列(internal ribosome entry site,IRES)，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构，从而使得直接从信使RNA(mRNA)中间起始翻译成为可能。它可在同一个载体中协同共表达两个目的基因，无需担心共转染的效率及其他共转染过程中可能产生的问题。当报告基因与目的基因协同共表达，其对目的蛋白生物活性的影响最低。常用构建于真核生物双顺反子(bicistronic mRNA)中间，如此一来，第一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，而第二个蛋白则依靠IRES起始翻译。IRES前后的两个蛋白的表达通常是成比例的，因此可以根据其中一个报告基因的表达情况来反映另外一个蛋白的表达情况。