[发明专利]一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法

权利要求书

1.一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其包括以下步骤 ：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备 ：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-2　0.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；

、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm；

、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

所述步骤对照品溶液的制备，采用精密称取新西兰牡荆苷-2粉末2.50mg，置于10 mL具塞锥形瓶中，加水溶解，定溶至刻度，配成0.25mg/mL的新西兰牡荆苷-2溶液，即得；

所述步骤供试品溶液的制备，采用精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末20.00mg，置于25 mL具塞锥形瓶中，加20 mL水，超声溶解，放冷，加水定容至25 mL，配制成0.80mg/mL的溪黄草水溶性总黄酮溶液，过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得；

所述步骤色谱条件，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.2～2.0%冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液；柱温20～40℃；紫外检测：波长300-400nm；流速：0.5～1.2ml/min；时间：80～120min;

所速步骤测定，采用精密吸取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法则定，得到指纹图谱。

3.根据权利要求1所述的一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

所述步骤色谱条件中流动相为甲醇与0.5%冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温：25℃；检测波长为334nm；流速为0.8ml/min；分析时间为110min。

4.根据权利要求2或3所述的一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

所述步骤色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为25%的甲醇溶液、流动相B为75%的0.5%冰乙酸水溶液；

25分钟时，流动相A为32%的甲醇溶液、流动相B为68%的0.5%冰乙酸水溶液；

40分钟时，流动相A为32%的甲醇溶液、流动相B为68%的0.5%冰乙酸水溶液；

45分钟时，流动相A为34%的甲醇溶液、流动相B为66%的0.5%冰乙酸水溶液；

70分钟时，流动相A为36%的甲醇溶液、流动相B为64%的0.5%冰乙酸水溶液；

90分钟时，流动相A为50%的甲醇溶液、流动相B为50%的0.5%冰乙酸水溶液；

110分钟时，流动相A为55%的甲醇溶液、流动相B为45%的0.5%冰乙酸水溶液。

5.一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

溪黄草水溶性总黄酮指纹图谱的建立，具体包括如下步骤：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备 ：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-2　0.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；

、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm；

、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；

所述指纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号色谱峰为新西兰牡荆苷-2参照峰，最强峰为3号色谱峰，图谱总长度为110min，具体如下：

1号峰，平均保留时间RT为27.51min，RSD为0.50%，峰面积为4350095.0，RSD为31.57%；

2号峰，平均保留时间RT为39.60min，RSD为0.35%，峰面积为787286.2，RSD为32.74%；

3号峰，平均保留时间RT为44.17min，RSD为0.28%，峰面积为5153721.0，RSD为31.64%；

4号峰，平均保留时间RT为46.80min，RSD为0.27%，峰面积为2331366.0，RSD为36.27%；

5号峰，平均保留时间RT为57.63min，RSD为0.62%，峰面积为799540.2，RSD为27.53%；

6号峰，平均保留时间RT为60.82min，RSD为0.44%，峰面积为401560.2，RSD为32.41%；

7号峰，平均保留时间RT为63.41min，RSD为0.35%，峰面积为760259.2，RSD为29.30%；

8号峰，平均保留时间RT为67.24min，RSD为0.26%，峰面积为2896423.0，RSD为30.69%；

9号峰，平均保留时间RT为68.77min，RSD为0.22%，峰面积为645521.3，RSD为28.04%；

10号峰，平均保留时间RT为71.25min，RSD为0.18%，峰面积为145838.7，RSD为33.18%；

11号峰，平均保留时间RT为76.82min，RSD为0.16%，峰面积为477461.3，RSD为40.66%；

12号峰，平均保留时间RT为92.48min，RSD为0.10%，峰面积为176274.2，RSD为64.53%。