[发明专利]一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取物及其质量控制方法，具体涉及溪黄草药材水溶性总黄酮的制备及其指纹图谱检测方法的建立。

背景技术

溪黄草原植物为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Isodon lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara.的干燥地上部分。主产于长江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、广东、广西、福建等省区。性味苦、甘、寒,归肝、胆经，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效，用于治疗湿热黄疸、湿热泻痢、跌打瘀痛、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎等疾病。

溪黄草为华南地区民间习用草药。溪黄草作为清肝利胆药在广东大部分地区民间有着很长的使用历史。民间和历代名医把溪黄草用作清热祛湿、利胆退黄药，治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎，为预防和治疗肝胆疾病的常用药。

溪黄草水提液具有较强的抗炎、保肝活性，溪黄草水提液中具有较多的水溶性成分，其中水溶性总黄酮所占比例较大。黄酮类化合物具有多方面的生物活性。溪黄草被载入2010版《中国药典》，质量控制方法有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的为制备溪黄草水溶性总黄酮，并建立其HPLC指纹图谱检测方法。

为达到本发明的目的所采用的技术方案：用现代色谱技术富集纯化溪黄草水溶性总黄酮，用高效液相色谱法建立溪黄草水溶性总黄酮的指纹图谱检测方法，具体包括如下步骤：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量 乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

②、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-20.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

③、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

④、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm。

⑤、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

进一步优选的方法可以通过下述步骤实施：

②对照品溶液的制备，采用精密称取新西兰牡荆苷-2粉末2.50mg，置于10mL具塞锥形瓶中，加水溶解，定溶至刻度，配成0.25mg/mL的新西兰牡荆苷-2溶液，即得。

③供试品溶液的制备，采用精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末20.00mg，置于25mL具塞锥形瓶中，加20mL水，超声溶解，放冷，加水定容至25mL，配制成0.80mg/mL的溪黄草水溶性总黄酮溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；

④色谱条件，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.2～2.0％冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液；柱温20～40℃；紫外检测：波长300-400nm；流速：0.5～1.2ml/min；时间：80～120min；

⑤测定，采用精密吸取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法则定，得到指纹图谱。

本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施:

步骤④色谱条件中流动相为甲醇与0.5％冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温：25℃；检测波长为334nm；流速为0.8ml/min；分析时间为110min。

步骤④色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液、流动相B为75％的0.5％冰乙酸水溶液；

25分钟时，流动相A为32％的甲醇溶液、流动相B为68％的0.5％冰乙酸水溶液；

40分钟时，流动相A为32％的甲醇溶液、流动相B为68％的0.5％冰乙酸水溶液；

45分钟时，流动相A为34％的甲醇溶液、流动相B为66％的0.5％冰乙酸水溶液；

70分钟时，流动相A为36％的甲醇溶液、流动相B为64％的0.5％冰乙酸水溶液；