[发明专利]高效非整合性人类iPSC诱导平台

说明书

技术领域

本发明涉及一种将人类体细胞诱导为iPSC的诱导剂、诱导方法及诱导培养基。

背景技术

iPSC的成功诱导是干细胞研究的一个重大突破，iPSC解决了人 ESC 研究中存在的伦理学等问题，避开了核移植技术缺乏人卵母细胞的难题，为干细胞和再生医学的临床应用提供新的种子细胞来源；同时，也为发育生物学、疾病发生发展机制、基因与蛋白质功能研究以及药物筛选等提供重要的研究平台。

现有将体细胞诱导为iPSC方法有多种，如基因敲除、整合外源基因、细胞因子诱导或其结合。基因敲除、在基因组中整合外源基因会改变基因组，导致得到的iPSC不够稳定，存在极大的癌变可能，这些风险的存在阻碍了其应用。

2007 年日本、美国的科学家 (Takahashi et al. 2007 ；Yu et al. 2007 ；Park et al. 2008) 相继报道，在人类体细胞中通过逆转录病毒（或慢病毒）过表达四个转录因子基因（Oct4，Sox2，Klf4 与c-Myc，或者Oct4，Sox2，Nanog 与Lin28），逆转人类成体细胞的分化状态，获得多能潜能干细胞（iPSC，induced pluripotent stem cell）。有报道证实，通过病毒载体导入Oct3/4 和Sox2 两种转录因子基因，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞（Danwei Huangfu，2008）。2009 年3 月5 日，Cell报道Rudolf Jaenisch 研究组利用Cre- 重组酶系统使诱导成功的帕金森病人iPSC 无外源因子，使iPSC 临床应用又推进了一步。2009 年3 月26 日，Science 报道俞君英等通过一种非整合质粒Episomal Vector 成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPSC（俞君英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞，科学，2009.324:7797-801）。人类体细胞重编程为多潜能干细胞（iPSC）是近两年来干细胞研究领域的重要里程碑事件。在2007-2008 年连续两年被science 杂志评为十大科学进展(Kennedy 2007 ；Vogel 2008)。多种研究表明，通过引入利于iPSC诱导的外源基因，有助于将体细胞诱导为iPSC。特别的，使用附加型（非整合型）载体转染外源基因，可以有效避免外源基因整合到基因组中，安全性有所提高，日益受到人们的重视。

纯化学试剂诱导iPSC完全避免了引入外源基因，具有更高的安全性，日益成为iPSC研究中的热点。小鼠体细胞是进行iPSC诱导研究时常用的对象，人们从其中获得了大量的研究数据。Ying et al，2008指出，包含糖原合酶激酶和丝裂原活化蛋白激酶信号抑制剂的（2i）培养基可以维持小鼠ES细胞处于基态。2013年7月18日，北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在《Science》杂志上发表了题为“Pluripotent Stem Cells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds ”的文章。文章中他们仅使用4个小分子化合物的组合对体细胞进行处理，成功逆转其“发育时钟”，重新赋予体细胞“多潜能性”，为诱导体细胞成为多能性干细胞提供了更加简单和安全的方法。此项工作之前，该研究小组报道了一种将多种小分子化合物“VC6T” [VPA，CHIR99021 (CHIR)，616452，Tranylcypromine]联合Oct4单个外源基因导入实现小鼠体细胞重编程的方法。通过在小鼠成纤维细胞（ mouse embryonic fibroblasts ，MEFs）中转入由OCT4启动子启动GFP表达的质粒系统（Oct4 promoter-driven GFP expression ，OG），利用启动GFP表达对10000多种化学小分子进行筛选，选出了For-skolin (FSK)等OCT4“替代物”。 随后，研究人员对多种化合物组合进行优化，并通过添加DZNep，一种已知可促成晚期重编程阶段的化合物，得到了完全重编程的细胞，并最终利用7个化合物组合的混合物，将重编程效率提高至0.2%，与目前常用的建立小鼠iPS细胞的技术相当。