[发明专利]一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种检测甘蔗属SPSB基因(JN584485)多态性的方法，及其在甘蔗糖分性状的标记辅助选择育种中快速建立遗传优良的甘蔗种质的应用。

背景技术

甘蔗是复杂的异源多倍体植物，细胞核内含有多套染色体组，在甘蔗杂交育种中主要以甘蔗属热带种(Saccharum.officinarum L.)，、甘蔗细茎野生种(又称割手密)(Saccharum spontaneum L.)、甘蔗大茎野生种(Saccharum robustu m B.)、甘蔗属中国种(Saccharum sinense R.)和甘蔗属印度种(Saccharum barberi J.)的种间杂交为主。因此杂交后代的性状分离严重，一个杂交花穗的后代有成百上千后代类型，不能精确各单倍型在后代的传递方式。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是甘蔗蔗糖合成最关键的酶之一，鉴定和分离出不同多态性的SPS基因对甘蔗的定向杂交与提高甘蔗蔗糖分具有重要的意义。目前，我国甘蔗育种还基本上以传统的杂交为主，从不同的杂交组合中选出性状优良的，高产高糖的品种。但这一方式耗费时间长，育成一个品种至少需要6年以上的时间，而且在选配杂交组合时仅从表型性状来选择父母本，加上甘蔗开花条件的限制，育成一个新品种的难度很大，因此如何从分子水平来指导甘蔗的品种选育成为育种家们关注的焦点。

甘蔗是我国重要的糖料作物，提高单位面积内甘蔗产量是甘蔗育种家们一直追求的目标。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的关键酶之一，共有4个家族，分别为SPSA、SPSB、SPSC、SPSD_Ⅲ和SPSD_Ⅳ,它们是甘蔗体内光合产物向蔗糖和淀粉分配的关键调控点，在该酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果糖生成六磷酸蔗糖，此产物在蔗糖磷酸酯酶的作用下形成蔗糖，与蔗糖的合成呈正相关，对甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因此，分析SPS基因遗传变异，特别是多态位点与甘蔗糖分性状的关联程度，对培育具有优良性状的甘蔗新品种和提高育种速度具有重要的理论指导意义。

目前国内外在甘蔗SPSB基因的克隆和功能方面的研究较多，主要从mRNA的角度来进行研究，但该基因的内含子区域并没有得到完整的克隆，其内含子区域的多态性分析也未见报道。SPSB基因与SPSA、SPSC基因普遍存在3个磷酸化位点，分别为14-3-3蛋白特异结合位点、光调控位点及渗透胁迫激活位点，并在相应酶的作用下行使着不同的功能。

发明内容

本发明解决的问题在于利用甘蔗属不同种的基因组DNA来筛查SPSB基因的多态性，寻找插入性较大的片段作为PCR检测的位点，从而提供一种快速检测SPSB基因多态性的方法，并以此作为甘蔗多态性的标记，为不同SPSB基因型的甘蔗杂交选育提供一定的指导。

本发明采用的技术方案如下：

一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，是设计一对引物SPSB2177P1扩增含多态的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，依据获得的电泳图谱条带类型判断SPSB基因多态类型，

包括如下步骤：

步骤(1)，模板的制备：提取被测样本的基因组DNA；

步骤(2)，引物设计：所述的引物对SPSB2177P1为：

上游引物：5’-TACATGGTTGGTTGTGGTGCT-3’；

下游引物：5’-GTGTCTGACTTGACGGGTGGT-3’；

步骤(3)，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤(4)，基因型的判断；

步骤(5)，SPSB基因多态结果鉴定。

上述技术方案中，所述的模板为甘蔗属大茎野生种51NG3、甘蔗属甘蔗细茎野生种(割手密)印割1号、甘蔗属热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori或甘蔗栽培种ROC22的基因组DNA。

上述技术方案中，所述的PCR扩增体系为：

上述技术方案中，所述的扩增程序为94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。

上述技术方案中，所述的琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配2.5％(w/v)琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μL Loading buffer混匀后上样，140V下电泳30min，紫外判断PCR条带大小，结果如图1所示。