[发明专利]转录组文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及文库构建领域，具体而言，涉及一种转录组文库的构建方法。

背景技术

利用第二代高通量测序技术对待测生物样品的转录本(mRNA和非编码RNA)进行测序，能够全面快速地获取特定待测生物样品在特定状态下的所有转录本的信息。通过转录组测序研究可以揭示待测生物样品不同表现型形成的分子调控机制。

转录组建库时通常先去除总RNA中的rRNA(可以利用Ribo-zero试剂盒进行去除)，然后利用现有技术中的RNA文库构建试剂盒进行转录组文库的构建(比如采用NEBUltra Directional RNA Library Prep Kit进行建库)，具体操作按试剂盒操作说明书进行。

然而，目前转录组文库构建方法往往会出现测序数据比对率(mapping率)低的问题。是通过测序完成后对文库测序数据进行核苷酸数据库(NT)比对来评估测序数据中的污染情况，即取10000条reads数据比对到NCBI核苷酸数据库(NT)，选取比对结果中的前5个同源比对，判定样本是否存在外源污染。这种文库构建方法和污染评估方法并不能改变其所构建的转录组文库测序数据比对率的状况，因此，仍需要对现有的转录组文库构建方法进行改进，以提高所构建的转录组文库后续得到的测序数据的比对率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种转录组文库的构建方法，以解决现有技术所构建的转录组文库后续得到的测序数据的比对率低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库的构建方法，该方法包括以下步骤：S1，对待测菌种中总RNA是否存在污染进行鉴定；S2，从未受污染的待测菌种的总RNA中去除rRNA，得到mRNA和非编码RNA；S3，对mRNA和非编码RNA进行转录组文库的构建，得到转录组文库。

进一步地，步骤S1中利用rRNA对待测菌种的总RNA是否存在污染进行鉴定。

进一步地，总RNA中的rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA。

进一步地，步骤S1包括以下步骤：S11，对待测菌种的总RNA进行反转录，得到cDNA；S12，以cDNA为模板，对待测菌种的rRNA进行扩增并测序，得到测序序列；S13，将测序序列与NCBI核苷酸数据库中的参考序列进行同源性比对，得到比对结果；S14，根据比对结果判断总RNA是否存在污染。

进一步地，rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA的全长序列。

进一步地，步骤S13中，比对结果为：(1)测序序列与至少前10条同源性高的参考序列来源于同一菌种，且菌种为目的菌种；或者(2)测序序列与至少前10条同源性高的参考序列来源于两种或两种以上的菌种。

进一步地，当比对结果为(1)时，步骤S14包括：根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若不存在，则判断总RNA不存在污染；当比对结果为(2)时，步骤S14包括：根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若存在，则判断总RNA存在污染。

进一步地，步骤S2采用Ribo-zero试剂盒从总RNA中去除rRNA。

进一步地，步骤S3包括以下步骤：S31，对mRNA和非编码RNA进行进行反转录，得到双链cDNA；S32，对双链cDNA依次进行末端修复、加A和连接头，得到带接头修复双链cDNA；S33，对带接头修复双链cDNA进行USER酶消化及PCR富集，得到转录组文库。

进一步地，在步骤S32之后以及步骤S33之前，还包括对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择的步骤，优选采用磁珠对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择。

应用本发明的技术方案，通过在利用待测物种的去除rRNA后的总RNA进行转录组文库构建之前，增加了对待测菌种的总RNA是否存在污染的鉴定步骤，通过增加对总RNA进行质控的步骤，在确定所欲构建转录组文库的RNA样品不存在污染的情况下，再进行后续的转录组文库构建步骤，避免了因RNA存在污染而对建库及后续测序工作造成的人力财力的浪费，也减少了对后续的测序数据进行分析而产生的不利影响。且该鉴定步骤所需样品量少，操作简单，在数小时之内即可获得结果，快速准确，同时具有高通量的能力，可以广泛用于转录组文库构建步骤中待测菌种总RNA污染情况的鉴定。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：