[发明专利]一种牙鲆精巢细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种牙鲆精巢细胞系的构建方法，其特征在于：

(1) 原代培养：取健康雄鱼精巢于含400 U/mL 青霉素、400 μg/mL 链霉素的DF12培养基中，PBS清洗后将精巢组织充分剪碎，并加入胰蛋白酶消化，而后用细胞培养液充分悬浮，离心收集沉淀，向沉淀中加入细胞培养液使其悬浮，25±0.2℃培养箱正置培养；次日，待组织块完成贴壁后小心补加细胞培养液；

(2) 传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出、增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25 %胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行原瓶初次传代培养,待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1:1-1:2（v/v）分瓶传代，以后7-10 d传代一次；传至10代后将细胞培养液中的血清含量减为细胞培养液总体积的10 %，目前，该细胞已经传至40余代，细胞系建立成功；

所述细胞培养液为在DF12培养液中加入占细胞培养液总体积20 %的胎牛血清，10 ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，15 ng/ml重组人表皮生长因子，pH值为7.2-7.4，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素，4℃存放，备用；

步骤(1)中清洗后精巢组织剪至肉眼未见明显颗粒；

在步骤(1)中精巢组织剪成糜状后，加入0.25（wt）%胰蛋白酶消化10 min；

在步骤(1)培养中的精巢组织外植体小块经短暂消化和离心收集后，先用细胞培养液悬浮后在培养箱中正置过夜培养，待组织块贴壁，第二天再补加细胞培养液；

在步骤(2)中，细胞初次传代时将吸出的旧培养基转入一备用离心管内，待细胞消化完成后在新鲜培养液中加入备用离心管内的旧培养液制备1:1（v/v）比例细胞悬液进行传代。